Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro

Соглашение о предоставлении №14.607.21.0129 от 27.10.2015г. (Минобрнауки Россиии)в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы»

Руководитель: Лисица Андрей Валерьевич

Сведения о ходе реализации проекта (этап №1)

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 октября 2015 г. №14.607.21.0129 с Минобрнауки России на этапе № 1 в период с 27 октября по 31 декабря выполнялись следующие работы:

    За счёт средств Субсидии:

  • 1.1. Обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИЭР.
  • 1.2. Проведение патентных исследований.
  • 1.3. Разработка протокола получения клеточного компонента тест-системы (ККТС) на За счёт внебюджетных средств:
    основе иммортализованных клеток.
  • Наработка экспериментальных образцов ККТС на основе иммортализованных клеток.
  • 1.5.Испытания экспериментальных образцов на соответствие требованиям ТЗ.
  • 1.6. Экспериментальное обоснование выбора контрольных веществ тест-системы (КВ) с использованием ККТС на основе иммортализованных клеток.
  • 1.7. Обоснование выбора тестируемых веществ (ТВ).
  • За счёт внебюджетных средств:

  • 1.8. Материально-техническое обеспечение работ по этапу.
  • 1.9. Экспериментальное обоснование выбора КВ на основании оценки их стабильности в водных растворах.
  • 1.10. Экспериментальные исследования КВ на лабораторных животных.
  • 1.11. Разработка регламента сбора, хранения и транспортировки биологических образцов.
  • 1.12. Организация банка биологических образцов и первичных клеточных культур.

При этом получены следующие результаты:
На основании изучения современной научно-технической, нормативной и методической литературы в исследуемой научно-технической области сделан вывод об актуальности и перспективности проведения ПНИЭР, возможности получения научных и научно-технических результатов, соответствующих мировому уровню. Анализ патентной литературы выявил высокую активность исследователей в создании моделей кожи in vitro для тестирования химической продукции на безопасность для здоровья человека в качестве альтернативных моделям на животных, возросшую в последние годы. Сделан вывод о возможности получения охраноспособных результатов ПНИЭР.

В результате экспериментальных исследований разработан протокол получения клеточного компонента тест-системы (ККТС) на основе клеток иммортализованной линии нормальных кератиноцитов человека НаСаТ, культивируемых на границе раздела фаз воздух-жидкость в системах типа Transwell на поверхности неполного дермального эквивалента на основе коллагена 1 типа. Протокол позволяет получить в течение 6 дней культивирования, как минимум, 2 слоя клеток, а в течение 10 дней — не менее 3 слоёв клеток. Сформированные клеточные слои ККТС экспрессируют специфические маркеры, характерные для пролиферирующих и дифференцированных кератиноцитов человека и располагаются типично для морфологической структуры эпидермиса in vivo. Проведенные испытания подтвердили полное соответствие экспериментальных образцов ККТС требованиям технического задания.

В результате теоретических и экспериментальных исследований (с использованием лабораторных животных и экспериментальных образцов ККТС) сделан вывод, что в качестве контрольных веществ могут быть использованы додецилсульфат натрия (SDS) или Тритон Х-100.

Осуществлен отбор тестовых веществ, относящихся к различным классам опасности по силе разъедающего действия на кожу (весьма коррозионное, коррозионное, некоррозионное — с учётом требований ГОСТ 32634-2014).

Проведено изучение правовой природы процедуры сбора биологических образцов человека и проводимого на их основе научного исследования в РФ и в мире, в результате чего разработан Регламент сбора, хранения и транспортировки биологических образцов — фрагментов нормальной кожи человека, необходимых для получения первичных культур кератиноцитов на 2 этапе исследования.

Таким образом, на первом этапе выполнения ПНИЭР выполнен весь комплекс теоретических и экспериментальных исследований, предусмотренных Планом-графиком соглашения № 14.607.21.0129 о предоставлении субсидии. ПНИЭР проведены в полном соответствии с техническим заданием, все поставленные задачи решены в полном объеме.

Сведения о ходе реализации проекта (этап №2)

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 октября 2015 г. №14.607.21.0129 с Минобрнауки России на этапе № 2 в период с 01 января по 31 декабря 2016 года выполнялись следующие работы:

За счёт средств Субсидии:

  • Экспериментально обоснован выбор базовых клеточных линий (БКЛ) для использования в разрабатываемой тест-системе (ТС).
  • Разработан протокол получения клеточного компонента ТС (ККТС) на основе БКЛ.
  • Разработаны программы и методики испытаний ТС (ПМ).
  • Наработаны экспериментальные образцы ККТС на основе БКЛ и проведены их испытания.
  • Продемонстрировано, что полученная модель кожи человека представляет собой многослойный ороговевающий эпителий.
  • Проведено экспериментальное обоснование выбора контрольных веществ тест-системы (КВ) с использованием ККТС на основе БКЛ.
  • Разработаны технические требования ТС.
  • Наработаны экспериментальные образцы ТС и проведены их испытания в соответствии с ПМ, проведена корректировка ТС.

За счёт внебюджетных средств:

  • Создан банк биологических образцов и первичных культур (сбор биологических образцов; разработка протокола выделения первичных культур кератиноцитов; оценка микробиологической безопасности культур).
  • Выполнено материально-техническое обеспечение работ.
  • Проанализирована стабильность КВ в растворах питательной среды (ПС).
  • Проведены экспериментальные исследования стабильности тестовых веществ (ТВ) в растворах ПС.
  • Установлена дозозависимая активность ТВ в отношении кожи животных.

При этом получены следующие результаты:

В результате проведенных экспериментальных исследований в качестве критериев оценки возможности использования первичных клеточных культур кератиноцитов в качестве базовой клеточной линии для наработки ККТС рекомендовано использовать показатели времени удвоения культуры (не более 72 часов) и максимального количества удвоений культуры (не менее 12). Кроме того, следует принимать во внимание жизнеспособность клеток в культуре после размораживания, которая должна составлять не менее 25%. Базовая клеточная линия должна удовлетворять каждому из требований, при ее несоответствии одному из параметров первичная клеточная линия не используется для наработки ККТС (отбраковывается).

На 2 этапе выполнения работ было проведено экспериментальное обоснование выбора контрольного вещества для проверки качества тест-системы (контрольное вещество тест-системы).

Методом протеомного анализа были оценены изменения в функциональном статусе клеток при воздействии различных субтоксических концентраций тритона Х-100. Было установлено, что воздействие тритона Х-100 на кератиноциты человека в различных концентрациях вызывает дозозависимые изменения протеомного профиля клеток, которые могут быть зарегистрированы как в результате качественного исследования протеома (профилирование протеома), так и при полуколичественном анализе. При этом наблюдается снижение процесса дифференцировки клеток, угнетение их энергетического обмена и активация процессов апоптоза.

В соответствии с требованиями ТЗ, была проведена экспериментальная апробации возможности использования выбранного контрольного вещества тест-системы — тритон Х-100, для установления нормативной величины показателя ET50 в отношении ККТС.

В соответствии с требованиями ТЗ, было экспериментально обосновано нормативное значения ET50 для ККТС в составе разрабатываемой ТС. Был установлен диапазон величин показателя ET50 для 1% раствора тритона Х-100 в разных сериях ККТС, а также предельно допустима величина нормативного показателя для разных партий ККТС — 3 часа, не менее.

Наработку экспериментальных образцов ККТС, подлежащих включению в состав ТС, проводили согласно ранее разработанному протоколу получения ККТС.

Далее комплектовали ТС в составе:
— клеточный̆ компонент (ККТС), 6 штук
— 24 луночный планшет;
— контрольные вещества (контрольное вещество ТС, отрицательное и положительное контрольные вещества, необходимые для проведения исследований согласно ГОСТ 32634-201. Всего для проведения испытаний было наработано 20 экспериментальных образцов ТС.

Таким образом, на втором этапе выполнения ПНИЭР выполнен весь комплекс теоретических и экспериментальных исследований, предусмотренных Планом-графиком соглашения № 14.607.21.0129 о предоставлении субсидии. ПНИЭР проведены в полном соответствии с техническим заданием, все поставленные задачи решены в полном объеме.

Сведения о ходе реализации проекта (этап №3)

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 октября 2015 г. №14.607.21.0129 с Минобрнауки России на этапе № 2 в период с 01 января по 31 декабря 2016 года выполнялись следующие работы:

За счёт средств Субсидии:

  • 1. Наработаны экспериментальные образцы ТС для отработки методики;
  • 2. Обоснован выбор контрольных (КВМ) и тестируемых (ТВМ) веществ для разработки методики;
  • 3. Установлены количественные значения критериев отнесения химических веществ, тестируемых в соответствии с методикой, к оазличным классам опасности для человека;
  • 4. Разработан проект методики по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи in vitro;
  • 5. Проведена экспериментальная апробация методики;
  • 6. Проведена корректировка методики;
  • 7. Проведена технико-экономическая оценка результатов ПНИЭР;
  • 8. Проведены дополнительные патентные исследования;
  • 9. Проведены дополнительные экспериментальные исследования: разработаны условия хранения и транспортировки ТС;
  • 10. Проведено обобщение и оценка полученных результатов;
  • 11. Разработан проект технического задания на проведение ОКР на тему «Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека»;
  • 12. Сформированы технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера;
  • 13. Разработан лабораторный регламент получения тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro.

За счёт внебюджетных средств:

  • 1. Выполнено материально-техническое обеспечение работ;
  • 2. Проведен анализ стабильности КВМ в водных растворах;
  • 3. Проведен анализ стабильности КВМ и ТВМ в питательных средах;
  • 4. Проведено исследование повреждающего/раздражающего действия КВМ и ТВМ на кожу лабораторных животных;
  • 5. Проведено пополнение банка биологических образцов и первичных культур;
  • 6. Проведена оценка воспроизводимости разработанной тест-системы и методики на базах Индустриальных партнеров.

Таким образом, на третьем этапе выполнения ПНИЭР выполнен весь комплекс теоретических и экспериментальных исследований, предусмотренных Планом-графиком соглашения № 14.607.21.0129 о предоставлении субсидии. ПНИЭР проведены в полном соответствии с техническим заданием, все поставленные задачи решены в полном объеме.