VIVOS VOCO: М.Л. Рабинович, М.С. Мельник, «Хвостатые ферменты»

Хвостатые ферменты

М.Л. Рабинович, М.С. Мельник

Михаил Лейбович Рабинович, доктор химических наук,
руководитель научно-учебного отдела биохимических проблем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН,
профессор кафедры системной экологии Российского университета дружбы народов.

Мария Степановна Мельник, кандидат химических наук, научный сотрудник того же института.

В истории борьбы США и Японии за господство на Тихом океане и в Юго-Восточной Азии в годы второй мировой войны помимо трагических моментов был и один курьезный эпизод, о котором не упоминают военные хроники. Дело в том, что поначалу американский десант нес весьма чувствительные потери от… микроскопической плесени. Во влажном и жарком климате эта удивительная зеленая плесень в считанные дни превращала в труху хлопчатобумажные, брезентовые тенты и палатки, оставляя элитные части армии под палящим солнцем и тропическими ливнями буквально в чем мать родила.

Положение казалось столь серьезным, что Министерство обороны США вынуждено было даже организовать специальный научный центр в Нейтике (штат Массачусетс). Именно там из разложившегося обмундирования выделили грибок, вырабатывающий необыкновенно агрессивные ферменты - целлюлазы, которые и разрушали целлюлозную основу ткани. Справедливости ради заметим, что на самом деле честь открытия расщепляющих целлюлозу микроорганизмов принадлежит нашему соотечественнику - русскому микробиологу В.Л.Омелянскому. Однако до работ американцев с помощью одних только ферментов (без микроорганизмов) удавалось разлагать лишь аморфные или растворимые производные целлюлозы, например карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), которая при заваривании образует студенистый клейстер (хорошо знакомый в быту обойный клей). Целлюлазы, разрезая длинные молекулы КМЦ, на глазах превращают студень в жиденький киселек. Ферменты же нового гриба этим не ограничивались. За пару дней при 30 - 50^оС и рН 4 - 5 они почти без остатка разлагали хлопковое волокно. А ведь хлопковая целлюлоза (так называемая целлюлоза I) имеет настоящую кристаллическую укладку, стабилизированную межмолекулярными водородными связями. Она настолько плотная, что между соседними молекулами не проникают даже протоны. Недаром отдельные кристаллиты хлопкового волокна выдерживают кипячение в крепких растворах соляной кислоты!

Чтобы объяснить различия с другими микроорганизмами, Э.Рис и его коллеги из Нейтика предположили, что новый грибок, названный в честь своего первооткрывателя Trichoderma reesei, образует особый фермент (С1), который первым действует на хлопковое волокно и переводит молекулы целлюлозы в аморфное состояние, делая доступными для остальных целлюлаз (Cx) [1].

Такую целлюлозу действительно можно получить, если залить хлопок 85%-й фосфорной кислотой и дать постоять в холодильнике. Получится студень наподобие клея КМЦ. Если постепенно разбавлять его водой, начнут выпадать хлопья аморфной целлюлозы. Она легко гидролизуется целлюлазами, превращаясь в глюкозу и ее димер - целлобиозу, но во влажном виде аморфная целлюлоза постепенно снова кристаллизуется. Правда, образует она уже не целлюлозу I, а иную упорядоченную структуру. Однако суть от этого не меняется: в условиях, в которых действуют целлюлазы, аморфная целлюлоза менее устойчива, чем кристаллическая. Значит, чтобы катализировать процесс набухания кристаллической целлюлозы, фермент должен получать энергию извне. Но откуда?

Как открывали хвост

После войны интерес к ферментам Риса долго носил преимущественно академический характер. Ситуацию изменил энергетический кризис, выявивший полную зависимость современной западной цивилизации от экспорта нефти. Естественно, сразу обострился интерес к альтернативным источникам энергии. Вспомнили и про целлюлозу, ежегодное воспроизводство которой составляет 100 млрд тонн. Целлюлазы превращают ее в глюкозу - удобное сырье для получения этанола, рассматриваемого как моторное топливо будущего. Потому они и оказались в центре внимания.

На волне всеобщего интереса в 1974 г. по инициативе И.В.Березина начались исследования целлюлаз и на химическом факультете МГУ. И почти сразу были получены результаты, которые никак не укладывались в общепринятые представления.

В те годы еще не были расшифрованы пространственные структуры сотен белков, известные ныне. Поэтому структура целлюлаз, по аналогии с одним из первых изученных ферментов - лизоцимом из яичного белка, представлялась довольно просто: в виде компактной глобулы с углублением (активным центром), в котором происходит каталитический разрыв целлюлозной цепи. Лизоцим действительно похож на целлюлазы: он хорошо разжижает карбоксиметилхитин - близкий аналог КМЦ - и имеет такой же механизм катализа.

Лизоцим можно выделить из смеси белков куриного яйца аффинной хроматографией. Для этого смесь пропускают через колонку с хитином из панциря креветок. Лизоцим задерживается, а другие белки выходят. Затем колонку промывают раствором вещества (например, карбоксиметилхитина), которое проникает в активный центр адсорбированного на хитине лизоцима и вытесняет его в раствор. Так получают чистый фермент уже без примесей других яичных белков.

Мы тоже попытались выделить целлюлазы аффинной хроматографией. Пропустили раствор образуемых грибом белков через колонку с целлюлозой. И сразу были озадачены: вместе с сопутствующими белками вышло и некоторое количество целлюлаз. Те же, что задержались, повели себя не менее неожиданно - никак не хотели покидать колонку, промытую концентрированным раствором КМЦ. Вязкость выходящего из колонки раствора КМЦ при этом была почти как у воды, значит, молекулы КМЦ, действительно, попадали в активный центр застрявших целлюлаз и там расщеплялись. Стало ясно, что ферменты цепляются за целлюлозу не активным центром, расщепляющим КМЦ, а чем-то иным, с чем КМЦ не взаимодействует. Очевидно, этот дополнительный центр связывания узнает не отдельные молекулы, а поверхность целлюлозы как целое.

Микрофотография поверхности целлюлозы I [12] и схема ее строения [9]. Каждое целлобиозное звено (одно из них выделено цветом) образует четыре водородные связи с соседними молекулами одного слоя. Внутримолекулярные водородные связи стабилизируют каждую цепь, межмолекулярные - прочно сшивают между собой соседние цепи. Целлюлозная молекула нижнего слоя показана черным цветом.

Одновременно с нами публиковали свои данные японские исследователи, которые изучали глюкоамилазу (фермент гриба Aspergillus awamori, превращающий крахмал в глюкозу), и обнаружили, что и этот грибной фермент прикрепляется к гранулам нерастворимого крахмала вовсе не активным центром, а другим участком полипептидной цепи. С помощью протеазы - субтилизина - удалось вырезать этот участок и проанализировать. Выяснилось, что он содержит 30 - 40 аминокислотных остатков и до 50% углеводов по массе. Укороченная глюкоамилаза переставала расщеплять гранулы сырого крахмала, но продолжала хорошо переваривать набухший крахмальный клейстер. Впоследствии было установлено, что в среде роста гриба содержится как полноразмерный фермент, так и его усеченные формы [2].

Среди целлюлаз Trichoderma reesei также обнаружены ферменты, которые различались почти на два порядка по эффективности связывания с поверхностью нерастворимой целлюлозы, хотя были одинаково активны по отношению к КМЦ. Это позволило заключить, что не у всех целлюлаз есть обособленный участок, позволяющий им связываться с нерастворимой целлюлозой. Вот тогда и вспомнили о С1-Сх-гипотезе американских исследователей и стали искать взаимосвязь между содержанием прочно связывающихся целлюлаз у разных грибов и их способностью разрушать кристаллическую целлюлозу. Такая корреляция вскоре была обнаружена, при этом оказалось, что дело вовсе не в концентрировании фермента на поверхности целлюлозы: даже 100-кратное увеличение количества плохо связывающихся ферментов не приводило к полному разложению кристаллической целлюлозы, зато с аморфной целлюлозой они справлялись очень эффективно.

Мы предположили, что фрагмент белковой молекулы специфически адсорбируется на поверхности целлюлозы и расклинивает пучки ее микрофибрилл, тем самым помогая проникать молекулам воды, в результате целлюлоза набухает, что в значительной мере облегчает работу ферментам-гидролазам [3]. Такое явление (адсорбционное понижение прочности, или эффект П.А.Ребиндера) широко известно в физико-химической механике. Однако, в отличие от Риса, мы считали, что дело не в специфическом типе ферментативного катализа, а в механическом расслоении целлюлозы на отдельные фибриллы, которые стабилизируются прочно адсорбированными белками, работающими как высокоспецифичные поверхностно-активные вещества. Для проверки своей гипотезы мы стали специально подавлять каталитическое действие прочно связывающихся ферментов снижением температуры и добавлением ингибиторов, однако и в этих условиях обработанная ферментами бумага при сильном встряхивании рассыпалась на отдельные волокна значительно легче, чем без них. Забегая вперед, заметим, что спустя почти 10 лет, в начале 90-х годов, к тому же выводу пришли и канадские специалисты из Ванкувера. Они показали, что выделенный ими сорбционный центр бактериальной целлюлазы хорошо диспергирует кристаллическую целлюлозу и помогает каталитической части фермента расщеплять ее даже в усеченном виде.

В 70-е же годы стало ясно, что белок, который Рис принимал за С1-фермент, в действительности обладает очень слабой, но вполне измеримой способностью к гидролизу целлюлозных молекул с образованием целлобиозы. Поэтому его переименовали в целлобиогидролазу. Так как Trichoderma reesei образует еще одну целлобиогидролазу, их обозначили соответственно как целлобиогидролазы I и II. Помимо них у гриба обнаружили от четырех до шести типов эндоглюканаз - Сх-ферментов, отвечающих за разжижение растворов КМЦ [4].

Чтобы выяснить, какие именно ферменты обладают центром прочной сорбции, из набора белков, вырабатываемых грибом, мы сначала отобрали те, которые прилипают к целлюлозе. Полученную целлюлозную пасту нанесли на поверхность пластины геля для изоэлектрофокусирования. Под действием электрического поля ферменты отрывались от неподвижных частиц целлюлозы и выстраивались в геле в соответствии со своими изоэлектрическими точками. Затем их окрасили специфическими красителями и сравнили полученную картину с результатами гельэлектрофореза исходного набора белков.

Выяснилось, что на целлюлозе прочно адсорбируются целлобиогидролазы I и II и эндоглюканазы I и II, но не эндоглюканаза III. Наиболее специфичным оказалось именно связывание целлобиогидролазы I - C1-фермента Риса. На основе полученных данных и был сформулирован новый механизм разложения кристаллической целлюлозы. Слабо сорбирующимся эндоглюканазам (усеченным формам эндоглюканаз I и II, а также эндоглюканазе III) отводилась в нем роль ферментов, расщепляющих внешние аморфные области целлюлозы и открывающих внутренние дефекты. Туда проникают прочно сорбирующиеся целлобиогидролазы и эндоглюканазы, расклинивающие пучки на отдельные фибриллы, которые постепенно разрушаются с разных концов целлюлозных молекул.

Как только в 1983 г. в журнале «Biotechnology» была опубликована полная аминокислотная последовательность целлобиогидролазы I [5], наше внимание сразу привлек богатый оксиаминокислотами фрагмент, который мог бы служить местом прикрепления углеводов и сорбционным центром, подобным имеющемуся у глюкоамилазы. Такой фрагмент - 20-членный пептид, в котором, чередуясь с остатками пролина, соседствуют 14 остатков треонина и серина, - находится вблизи С-конца молекулы. Нуклеотидная последовательность, кодирующая С-концевой участок молекулы целлобиогидролазы, отделена от остальной части гена незначащей вставкой (интроном). Все это позволило заключить, что центр связывания у целлюлаз - самостоятельная структура, которая работает подобно якорю, хвосту или клину, а не как капкан, захватывающий молекулу целлюлозы. К сожалению, рукопись заказанного в 1983 г. на эту тему обзора пролежала в издательстве «Наука» четыре года; к тому же научный редактор убрал в окончательном варианте слишком образные сравнения. А жаль. Впрочем, отличить предвидение от фантазии действительно нелегко.

Структура сорбционного центра (целлюлозосвязывающего домена) целлобиогидролазы I [11]. «Лапы» - это три остатка тирозина, непосредственно взаимодействующие с гидрофобными частями остатков глюкозы на поверхности целлюлозы. Стрелками обозначены бета-тяжи - элементы вторичной структуры белка.

Предсказанная конструкция сорбционного центра давала возможность конструировать самые разные гибридные белки: хвостатые ферменты, антитела, токсины, белковые ингибиторы. На их основе можно было бы создавать биоактивные ткани и перевязочные материалы, специфические тест-системы на полосках бумаги, наконец, фармпрепараты пролонгированного действия на микрокристаллической целлюлозе. Однако отделить от целлобиогидролазы I участок связывания на целлюлозе и определить его последовательность нам не удалось, хотя были испытаны разные протеазы: субтилизин, трипсин, химотрипсин.

Лишь через три года с этой задачей справились в совместной работе специалисты из Бельгии и Швеции. Для этого они использовали протеазу иного типа - папаин. Полученные ими данные в основном подтвердили наши предположения, но не полностью. Богатый пролином и треонином фрагмент, принятый нами за сорбционный центр, оказался линкером - связкой между двумя частями молекулы целлобиогидролазы I. Именно там и действовал папаин: он вызывал появление в растворе каталитической части фермента, которую легко увидеть по катализируемой ею специфической реакции с флуоресцентным производным целлобиозы. Хвост же остается на поверхности, откуда его можно смыть детергентом (проще говоря, стиральным порошком). Он оказался 35-членным пептидом, расположенным на С-конце молекулы фермента сразу вслед за линкером. Связывание его с целлюлозой обеспечивали три остатка тирозина [6].

В 1989 г. финские, шведские и американские исследователи совместными усилиями расшифровали пространственную структуру сорбционного центра (или субстратсвязывающего модуля, как теперь говорят) целлобиогидролазы I. Он, действительно, имеет клиновидную форму с двумя плоскими гранями - гидрофильной и гидрофобной, обращенной к поверхности целлюлозы. Линкер, связывающий его с каталитической частью, имеет гибкую (шарнирную) и жесткую (гликозилированную) части [7].

Интересно, что хвостовая часть грибных целлюлаз по своей форме очень напоминает совсем, казалось бы, далекий белок - низкомолекулярный ингибитор протеаз из картофеля. Трудно сказать, случайное ли это совпадение. Однако заметим, что ингибиторы протеаз иногда тоже выполняют функции хвоста у ферментов, которые они ингибируют. Так построена, например, панкреатическая прокарбоксипептидаза А.

Фермент образуется в неактивном состоянии (как змея, кусающая свой хвост), когда ингибитор «затыкает» активный центр фермента, не давая ему начать работу раньше времени [8]. Расщепление линкера протеазой ведет к отделению хвостового фрагмента и активации фермента.