VIVOS VOCO: А.П.Каплун, И.В.Жигальцев, В.И.Швец, "Конструирование лекарств для лечения болезни Паркинсона"

Конструирование лекарств
для лечения болезни Паркинсона

А.П.Каплун, И.В.Жигальцев, В.И.Швец

Виталий Иванович Швец, д. хим. наук, чл.-корр. РАМН,
проректор и зав. каф. биотехнологии МИТХТ им.М.В.Ломоносова.
Александр Петрович Каплун, д. хим. наук, профессор той же кафедры.
Игорь Валерьянович Жигальцев, канд. хим. наук, стажер той же кафедры.

Атланта-96. Олимпийский факел в руках Мохаммеда Али. Кто смотрел репортаж, заметил, что выдающийся боксер страдает болезнью Паркинсона. Телезрители могли наблюдать все основные симптомы этого заболевания: ригидность, тремор, гипокинезия. В переводе на русский это означает: излишний тонус в мышцах, дрожание отдельных частей тела и малая подвижность, которая впоследствии может привести к акинезии — полной неподвижности.

Паркинсонизм — довольно распространенное (100 больных на 100 тыс. населения) хроническое заболевание среди людей пожилого возраста. В 60-х годах было обнаружено, что при болезни Паркинсона в стриатуме (одном из подкорковых отделов мозга, участвующем в координации двигательной активности и формировании эмоциональной реакции) понижено содержание нейромедиатора дофамина. Возникает это заболевание вследствие нарушений функций черного тела (структуры среднего мозга), причиной которых могут стать и вирусная инфекция, и опухоль, и механические повреждения нейронов черного тела, и поражения их токсическими веществами. В последнее время среди больных паркинсонизмом все больше молодых людей. Очевидно, это связано с распространением наркотика (крэка), в котором присутствует токсичная для нейронов черного тела примесь. Кроме того, в окружающей нас среде наверняка есть и другие подобные, но пока еще не идентифицированные, токсины.

Барьеры, барьеры, кругом одни барьеры

Итак, в нейронах черного тела вырабатывается дофамин, который затем выделяется в синаптическую щель (пространство между мембранами контактирующих нервных клеток, где происходит передача импульсов), и этот сигнал принимается нейронами стриатума. Следовательно, можно предположить, что, компенсировав недостаток дофамина в этом отделе мозга, можно снять симптомы заболевания. Такой метод лечения называют заместительной терапией, а самым эффективным способом доставки дофамина могла бы быть инъекция его раствора непосредственно в стриатум, но это — очень рискованно и небезопасно для пациента.

Попробовали вводить дофамин внутрь. Никакого эффекта! В чем же дело? Оказалось, что при таком введении дофамин появляется в кровотоке и тканях практически во всех органах, но только не в мозге. Почему?

В желудочно-кишечном тракте всасываются только те вещества, которые способны преодолеть мембрану эпителиальных клеток (энтероцитов) с помощью специфических переносчиков. Также могут проходить гидрофобные вещества, так как они растворимы в липидной мембране клеток. Затем “счастливчики” оказываются в капиллярах, и на их пути возникает новый барьер — печень, где находятся ферменты, разрушающие чужеродные для организма соединения (ксенобиотики). В крови тоже присутствуют ферменты, которые могут разрушать лекарство. Уже на этом этапе, в кровотоке оказывается порой менее 50% препарата, а ведь впереди еще одно очень серьезное препятствие — гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — барьер между кровью и мозгом, по-английски это выглядит почти мистически: blood-brain barrier (bbb). Но этот барьер имеет вполне физическую природу. Капилляры мозга в отличие от всех других капилляров не имеют никаких пор. Клетки эпителия в них плотно прилегают друг к другу, и между ними ничто не просочится. Вообще-то капилляры существуют для того, чтобы снабжать органы и ткани питательными веществами, для этого-то им всем и нужны поры. Всем, кроме капилляров мозга. Мозг как центральный орган охраняется особенно тщательно от проникновения большинства соединений. У тех же питательных веществ, которые должны попасть в мозг (аминокислоты, пурины, глюкоза и т.п.), есть специальные переносчики через мембраны эпителиальных клеток капилляров. Все прочие, которые не могут быть узнанными белками-переносчиками (как, например, дофамин), в мозг проникнуть не могут.

Но многие на собственном опыте знают, что есть вещества, которые не относятся к питательным, но после приема внутрь довольно быстро оказываются в мозге. Все, кто выпил хотя бы рюмку вина, почувствовал действие спирта на мозг. Есть и другие соединения, которые попадают в мозг, не имея специальных переносчиков: наркотики, успокаивающие препараты, релаксанты, транквилизаторы. Как им это удается? Проходят не в дверь, где проверяют по списку, а сквозь неохраняемый забор. Дело в том, что все перечисленные вещества — амфифильные, в их структуре представлены как полярные, так и гидрофобные группы. Поэтому они прилично растворимы не только в воде, но и в гидрофобной мембране клеток. Дофамин — слишком полярное соединение (отлично растворяется в воде, но очень плохо в липидной мембране), поэтому “сквозь стену” эпителия капилляров мозга ему не пройти.

Схема прохождения ДОФА (биосинтетического предшественника дофамина) через плотный слой эпителиальных клеток капилляров головного мозга и его превращения в активный дофамин (выделено цветными стрелками). ДОФА использует переносчика тирозина (выделено цветом), а дофамин и дигидроксибензиламин этот переносчик не узнает, потому им сквозь мембрану не пройти.

Лекарство в маскхалате

К счастью, у дофамина есть биосинтетический предшественник — дигидроксифенилаланин (ДОФА), который может проникнуть сквозь ГЭБ с помощью переносчика тирозина — аминокислоты, отличающейся от ДОФА лишь одной гидроксильной группой. Попав в мозг, ДОФА подвергается декарбоксилированию и превращается в дофамин. Такой прием, когда для улучшения биодоступности или других фармакокинетических параметров лекарственного вещества на него “надевают” маскирующие фрагменты, известен довольно давно, а предшественник, превращающийся в организме в активное соединение, называется пролекарством.

В наши дни ДОФА — основной, но далеко не идеальный препарат для лечения болезни Паркинсона. Он проникает в мозг, но в другие органы проходит не хуже, поэтому, чтобы создать нужную концентрацию в капиллярах мозга, требуются лошадиные дозы. Вот выписки из знаменитого справочника М.Д. Машковского: “Начальная доза 0.25 г в день, которую при необходимости увеличивают до 4—5 г, а при хорошей переносимости суточная доза достигает 6 г. При развитии побочных явлений уменьшают дозу или прекращают прием препарата”. А побочные явления — это “диспепсия, ортостатическая гипотония, аритмии, гиперкинезы, головная боль, гипергидроз и др.”.

Большинство перечисленных явлений связано с преждевременным декарбоксилированием ДОФА в дофамин в периферических тканях, куда он может забредать по пути в мозг, что, естественно, приводит и к снижению (до 80%) концентрации ДОФА в крови. В некоторых органах (в сердце, в почках) есть дофаминовые рецепторы, и поэтому образующийся в результате биотрансформации дофамин вызывает побочные эффекты в этих органах. Для ослабления периферического декарбоксилирования применяют смесь ДОФА с ингибиторами ферментов, разрушающих ДОФА, но и это дает незначительный эффект.

“Кто нам мешал, тот нам и поможет!”

Есть очень элегантный способ увеличить селективность лекарства по отношению к мозгу. Этот способ напоминает ситуацию в фильме “Кавказская пленница”. Там, если вы помните, прозвучала фраза: “Кто нам мешал, тот нам и поможет!” Дело в том, что ГЭБ не проницаем для полярных веществ в обоих направлениях. Если создать гидрофобное пролекарство, которое, проникая в ткани, становилось бы полярным, его селективность в этом случае повысилась за счет того, что оно не смогло бы уже выйти из мозга, тогда как в других тканях, где есть поры, такое превращение не мешает обратному выходу. Таким образом, активное вещество накапливалось бы в мозге.

Разработал этот методический прием очень плодовитый идеями американский химик Н.Бодор, предложивший соединить молекулы лекарства с производными никотиновой кислоты, которые легко окисляются под действием ферментов (Bodor N. Pharmaceutical formulations for parenteral use containing cyclodextrins and dihydropyridine redox systems (Eur. Pat. №335 545. 1989.)). Про-пролекарство (DN) получают в восстановленном виде и вводят в организм; в тканях оно окисляется до заряженного и поэтому нерастворимого в мембране пролекарства (DN⁺), затем в мозге амидная связь гидролизуется, и образуется дофамин (D).

Селективность распределения способных к окислению производных никотиновой кислоты. Гидрофобное про-пролекарство — конъюгат дофамина и N-метилникотиновой кислоты (DN) — легко проходит через стенки капилляров, попадает в ткани, там окисляется, образуя заряженное пролекарство (DN+) , и становится нерастворимым в мембране клеток. Обратно он может выйти, только если в капиллярах есть поры, в капиллярах же мозга их нет, поэтому окисленный конъюгат там задерживается.

Гидрокостюм для лекарств, не любящих воду

Гидрофобные соединения, естественно, плохо растворимы в воде (общее правило: чем лучше вещество растворяется в мембране клеток, тем хуже — в воде). С этим связаны трудности, которые возникают при создании в кровотоке нужных концентраций гидрофобных лекарств. Для повышения биодоступности надо подобрать подходящий переносчик. Как природа решила эту проблему? Ведь существуют гидрофобные, не растворимые в воде витамины (А, Д, Е), гормоны (тироксин, половые гормоны), липиды (холестерин, жиры), которые нужно переносить от места синтеза ко всем клеткам. Для каждого из таких веществ существуют белки-переносчики, а для холестерина — контейнеры: липопротеины, состоящие из многих тысяч молекул. Они хорошо растворимы в воде, так как на их поверхности экспонированы полярные аминокислоты, и имеют “карманы”, выстланные гидрофобными аминокислотами. Химики для этих целей предложили циклодекстрины, у которых поверхность гидрофильная, а полость гидрофобная. Именно в эту полость могут включаться гидрофобные соединения соответствующего размера.

Переносчики гидрофобных веществ: белок-переносчик жирорастворимых витаминов (эллипс слева) и искусственный переносчик — циклодекстрин. Белок хорошо растворим в воде, так как его поверхность состоит из полярных аминокислот. В его “карман”, выстланный гидрофобными аминокислотами, помещаются переносимые вещества (изображен витамин А). Циклодекстрин — водорастворимый олигосахарид, в его канал могут входить гидрофобные вещества подходящего размера (показан DN).

Батискаф для любых лекарств

Липосомы (фосфолипидные пузырьки) давно исследуются как перспективная лекарственная форма, существенным образом меняющая распределение лекарственного вещества и защищающая его от воздействия ферментов; пригодились они и нам. Эти микросферы (размером от 25 нм до 1 мкм) служат контейнерами для лекарственных веществ, причем полярные соединения располагаются во внутреннем водном объеме липосом, а гидрофобные — хорошо растворяются в мембране. Мы занялись разработкой липосомной формы ДОФА, надеясь, что они будут обладать определенными преимуществами перед раствором. Во-первых, мембрана липосом предохранит ДОФА от преждевременного декарбоксилирования и не допустит падения концентрации активного вещества в крови. Таким образом, отпадет необходимость в использовании лошадиных доз препарата. Во-вторых, так как поры капилляров меньше диаметра липосом, они не смогут покинуть кровоток, а, следовательно, ДОФА не попадет в периферические ткани и не вызовет побочных явлений.

Схема липосомы — переносчика лекарственных веществ, мембрана которой выстлана природными фосфолипидами. Во внутреннем водном объеме располагаются водорастворимые вещества (например, ДОФА или дофамин), в липидной мембране липосома может переносить гидрофобные вещества.

Предстояло проверить наши предположения в эксперименте. Липосомы получают в растворе активного вещества, при этом внутрь липосом попадает только 8—10% ДОФА, все остальное удаляется с помощью диализа или гельфильтрации (вид хроматографии, позволяющий разделять вещества по размеру). Липосомы вводили мышам с синдромом Паркинсона, который развивался у них под действием 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР) — еще одного гидрофобного аналога дофамина. МРТР хорошо проникает в мозг, где окисляется до четвертичной соли, но не может выйти оттуда (как упомянутый окисленный конъюгат дофамина и никотиновой кислоты) и повреждает клетки, вырабатывающие дофамин.

О формировании синдрома Паркинсона судили по снижению двигательной активности у испытуемых. После введения липосомного препарата ДОФА наблюдали за их состоянием и сравнивали с поведением контрольных мышей. Полный эксперимент занимал почти месяц.

В результате выяснилось, что липосомный препарат в дозе, в 10 раз меньшей, чем раствор ДОФА, давал более выраженный антипаркинсонический эффект. Таким образом, наши надежды полностью оправдались. Кроме того, действие липосомного препарата длится почти в три раза дольше, чем раствора ДОФА. Но самое удивительное обнаружилось, когда испытали липосомы, нагруженные дофамином: они оказывали почти то же действие, тогда как раствор дофамина (который, как уже отмечалось, практически не проникает через ГЭБ) никакого эффекта не давал! Объяснить этот факт можно тем, что липосомы непосредственно способствуют “протаскиванию” своего содержимого через ГЭБ, но прямо подтвердить лучшее проникновение биогенных аминов, загруженных в липосомы, оказалось затруднительным. В наших экспериментах мы определяли в мозге концентрацию вводимых веществ и их метаболитов, но понять, какая часть дофамина образуется из введенного препарата, а какая синтезировалась мозгом, без использования меченых соединений было невозможно.

Сравнение двигательной активности мышей различных групп. Действие липосомного препарата ДОФА на мышей с синдромом Паркинсона (выделено цветом) вызвало более выраженный антипаркинсонический эффект по сравнению с раствором этого препарата (второй столбик слева). Контролем служили больные и здоровые животные, которым вводили только физраствор (третий и четвертый столбики соответственно).

Не имея гербовой, пишем на простой

Так как эксперименты с мечеными соединениями очень дорогостоящи (и не безвредны), мы провели опыт с липосомной формой неприродного аналога дофамина — дигидроксибензиламина. В мозге это соединение не синтезируется и сквозь ГЭБ самостоятельно проходит плохо, поэтому преодолеть ГЭБ и оказаться в мозге в больших количествах он может только благодаря липосомам. С помощью этого эксперимента удалось подсчитать, что концентрация дигидроксибензиламина в стриатуме мышей при использовании липосом в 100 раз больше, чем в случае введения раствора.

Зная массу мыши и объем ее крови, легко прикинуть максимальное отличие концентраций активного вещества (дигидроксибензиламина или ДОФА, или дофамина) в крови при введении двух различных лекарственных форм: липосомного препарата и раствора. Даже если допустить, что лекарство из раствора равномерно распределилось по всем тканям организма животного, а заключенное в липосомы вещество не покидает кровотока и совсем не разрушается (ни того, ни другого на самом деле в полной степени не бывает), то и в этом случае концентрация липосомного препарата не может превысить концентрацию лекарства, введенного в виде раствора, более чем в 50 раз.

Объяснить столь большую разницу (в 100 раз в стриатуме и в 50 — в крови) пока трудно, но у нас есть некоторые предположения, которые еще предстоит проверить. Ситуация вполне обычная — долгое время был неизвестен механизм действия аспирина, что не мешало его успешно использовать.

Активно накачиваем липосомы лекарством

Помимо очевидных преимуществ использования липосом существует и большой недостаток. Напомним, что при стандартном способе загрузки липосом активного вещества в них из раствора поступает немного. Поэтому для достижения необходимого эффекта приходится вводить большое количество липосом, вместе с которыми в организм попадает не только лекарство, но и фосфолипиды липосом. Хотя фосфолипиды — обычные вещества в человеческом организме (из них состоят мембраны всех клеток), тем не менее слишком большие их количества могут нарушить работу печени.

Для увеличения удельной загрузки мы использовали прием, называемый активной загрузкой. Он основан на значительной разнице в проницаемости липидной мембраны для нейтральных и заряженных (протонированных) форм молекул дофамина. В растворе дофамина преобладают заряженные формы, но всегда присутствует и некоторое количество нейтральных. Незаряженные молекулы более гидрофобны и, как мы уже неоднократно упоминали, лучше растворимы в липидной мембране клеток и липосом. Если в суспензии “пустых”, ничем не загруженных липосом растворить дофамин, то диффузия нейтральной части популяции его молекул через мембрану приводит к постепенному переходу дофамина внутрь липосом. Накопление дофамина будет продолжаться до тех пор, пока не наступит динамическое равновесие и концентрации вещества внутри и вне липосом не сравняются. А что, если попробовать найти способ помешать обратному выходу дофамина из липосом? Тогда удастся превысить теоретический предел загрузки липосом активным веществом, и в этом случае она станет “активной”.

Схема активной загрузки липосомы дофамином в присутствии сульфата аммония (NH₄)₂SO₄. DA — дофамин в нейтральной форме, DAH⁺— в заряженной (протонированной) форме.

Способ был найден: при подкислении внутреннего объема липосом проникшие в него нейтральные молекулы присоединяют протон, приобретают положительный заряд и уже не могут выйти обратно (вспомните идеи Бодора). Чем ниже рН внутри липосом, тем больше вещества перераспределяется из внешнего объема во внутренний. Не затрачивая никаких усилий, мы теперь можем “накачать” внутрь липосом весь растворенный дофамин — хватило бы силы кислого буфера. Казалось бы, проблема решена, но… через несколько часов рН внутри и вне липосом выравнивается, так как маленькие протоны довольно хорошо проходят через мембрану, и, следовательно, концентрации дофамина внутри и вне липосом выравниваются.

Стало быть, задача состоит в том, чтобы источник ионов водорода действовал внутри липосом как можно дольше. Исследовательская группа И. Баренхольца из Израиля предложила заполнять липосомы не кислым буфером, а раствором неорганической соли — сульфатом аммония (NH₄)₂SO₄. При гидролизе этой соли образуется аммиак, который, будучи молекулой незаряженной, легко проникает через мембрану и уходит во внешний раствор (в начальный момент концентрация и (NH₄)₂SO₄, и NH₃ вне липосом пренебрежимо мала). При этом каждая молекула NH₃, покидающая липосому, оставляет ей “на память” протон, который и служит приманкой для незаряженных гостевых молекул. Созданный таким образом трансмембранный градиент концентраций протонов невелик, но сохраняется в течение многих недель. Используя этот прием, израильским исследователям удалось перераспределить в липосомы более 90% от вносимого в дисперсию липосом целевого вещества — доксорубицина (Haran G. , Cohen R. , Bar L. K. , Barenholz Y. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V.1151. P.201—215.). Полученный липосомный препарат проявлял исключительную стабильность и выдержал клинические испытания.

Успех израильских ученых вдохновил нас, и мы попытались использовать их метод для решения нашей проблемы — загрузки липосом дофамином. Были и сомнения: ведь дофамин, в отличие от доксорубицина, вещество весьма и весьма гидрофильное, и удержать его внутри липосом будет гораздо сложнее. Действительно, наши первые попытки нельзя было назвать удачными, однако в конце концов мы повторили израильский рекорд на нашем материале: 89% дофамина в течение получаса переходило в липосомы из внешнего раствора, и оставалось там несколько недель.

Липосомы, нагруженные дофамином таким способом, показали замечательные результаты в биологических испытаниях. В малых дозах они практически полностью восстанавливали двигательную активность у мышей с синдромом Паркинсона. И это не удивительно, биохимические тесты продемонстрировали, что уровень дофамина в стриатуме таких мышей почти сравнялся с нормой.

Сравнение содержания дофамина в стриатуме после введения липосом, полученных традиционным способом (слева) и активно загруженных.
1 — здоровые животные, которым вводили только физраствор
2 — больные нелеченые животные
3 — леченые животные с синдромом Паркинсона.

* * *

В заключение нельзя не упомянуть еще об одном очень перспективном направлении в развитии лекарственных форм. Вместо того чтобы периодически вводить лекарство извне, можно один раз под оболочки мозга трансплантировать клетки, синтезирующие дофамин. А для предотвращения отторжения чужеродных клеток иммунной системой их заключают в микросферы, полупроницаемая мембрана которых состоит из биосовместимого полимера. Мембрана пропускает питательные вещества к трансплантату, а дофамин — обратно, но для клеток иммунной системы она — абсолютный барьер.

Эта процедура выглядит несколько экстравагантно, однако десятки лабораторий идут именно по этому пути. Особенно успешно продвигаются исследования в создании микрокапсул с продуцирующими инсулин b-клетками, предназначенных для лечения сахарного диабета. Хочется верить, что эти, своего рода микрофармацевтические фабрики внутри организма пациента станут реальностью уже в ближайшем будущем.