VIVOS VOCO: А.В. Вершинин, "Центромеры и теломеры хромосом"

№9, 2007 г.

Центромеры и теломеры хромосом

А.В. Вершинин

Александр Васильевич Вершинин, д.б.н., гл.научн.сотр. Института цитологии и генетики СО РАН.

Что такое хромосомы, сегодня известно почти каждому. Эти ядерные органеллы, в которых локализуются все гены, и составляют кариотип данного вида. Под микроскопом хромосомы выглядят как однородные, вытянутые темные палочкообразные структуры, и вряд ли увиденная картина покажется интригующим зрелищем. Тем более, что препараты хромосом великого множества живых существ, обитающих на Земле, отличаются разве что числом этих палочек да модификациями их формы. Однако есть два свойства, характерные для хромосом всех видов. Первое - наличие обязательного сжатия (или перетяжки), расположенного или посередине, или смещенного к одному из концов хромосомы, получившего название “центромера”. Второе - присутствие на каждом конце хромосомы специализированной структуры - теломеры (рис.1). Различные гены, расположенные вдоль плеч (частей хромосомы от центромеры до физического конца) хромосом, вместе с регуляторными последовательностями ДНК ответственны за выполнение разнообразных функций. Это и обеспечивает уникальность генетической информации, закодированной в каждом плече каждой отдельной хромосомы.

Рис. 1. Типичная метафазная хромосома.
Каждая хроматида содержит одну из двух идентичных молекул ДНК.

Центромерные и теломерные районы занимают особое положение, ибо выполняют крайне важные, но одни и те же функции в хромосомах всех видов эукариот. Многочисленные исследования пока не дали ясного ответа на вопрос, какие молекулярные структуры ответственны за выполнение этих функций и как они их осуществляют, но очевидный прогресс в этом направлении в последние годы достигнут.

До выяснения молекулярной структуры центромер и теломер полагали, что их функции должны определяться (кодироваться) универсальными и в тоже время специфичными для данных районов последовательностями ДНК. Но прямое определение первичной последовательности нуклеотидов (секвенирование ДНК) осложнялось тем, что эти районы, как правило, соседствуют в хромосомах с участками высокой концентрации повторяющихся последовательностей ДНК. Что сегодня известно об этих функционально важных районах хромосом?

Центромеры

К середине прошлого столетия многочисленные цитологические исследования показали определяющую роль центромеры в морфологии хромосом. Позднее установили, что центромера вместе с кинетохором (структурой, состоящей в основном из белков) ответственна за правильное расхождение хромосом в дочерние клетки в ходе клеточного деления. Направляющая роль центромеры в этом процессе очевидна: ведь именно к ней прикрепляется веретено деления, которое вместе с клеточными центрами (полюсами) составляет аппарат клеточного деления. Благодаря сокращению нитей веретена хромосомы движутся во время деления к полюсам клетки.

Обычно описывают пять стадий клеточного деления (митоза). Для простоты мы остановимся на трех основных этапах в поведении хромосом делящейся клетки (рис.2). На первом этапе происходит постепенное линейное сжатие и утолщение хромосом, затем образуется веретено деления клетки, состоящее из микротрубочек. На втором хромосомы постепенно продвигаются к центру ядра и выстраиваются вдоль экватора, вероятно, чтобы облегчить присоединение микротрубочек к центромерам. При этом ядерная оболочка исчезает. На последнем этапе половинки хромосом - хроматиды - расходятся. Создается впечатление, что микротрубочки, прикрепленные к центромерам, как буксир, тянут хроматиды к полюсам клетки. С момента расхождения бывшие сестринские хроматиды называются дочерними хромосомами. Они достигают полюсов веретена и собираются вместе в параллельном порядке. Образуется ядерная оболочка.

Рис. 2. Основные этапы митоза.
Слева направо: компактизация хромосом, образование веретена деления; выстраивание хромосом вдоль экватора клетки,
прикрепление веретена деления к центромерам; движение хроматид к полюсам клетки.

При тщательном наблюдении можно заметить, что в процессе клеточного деления в каждой хромосоме центромера находится на постоянной позиции. Она поддерживает тесную динамическую связь с клеточным центром (полюсом). Деление центромер происходит одновременно во всех хромосомах.

Разработанные в последние годы методы секвенирования позволили определить первичную структуру ДНК протяженных участков центромер человека, плодовой мухи Drosophila и растения Arabidopsis. Оказалось, что в хромосомах и человека, и растения центромерная активность связана с блоком тандемно организованных повторов (мономеров) ДНК, близких по размеру (170-180 нуклеотидных пар, нп). Такие участки называют сателлитной ДНК. У многих видов, в том числе и эволюционно далеких друг от друга, размер мономеров почти не отличается: различные виды обезьян - 171 нп, кукуруза - 180 нп, рис - 168 нп, насекомое хирономус - 155 нп. Возможно, это отражает общие требования, необходимые для центромерной функции.

Несмотря на то, что третичная структура центромер человека и арабидопсиса организована одинаково, первичные последовательности нуклеотидов (или порядок нуклеотидов) в их мономерах оказались совершенно разными (рис.3). Это удивительно для района хромосомы, выполняющего столь важную и универсальную функцию. Однако при анализе молекулярной организации центромер у дрозофилы обнаружили определенную структурную закономерность, а именно наличие участков из мономеров примерно одного размера. Так, у дрозофилы центромера Х-хромосомы состоит в основном из двух типов очень коротких простых повторов (ААТАТ и ААGАG), прерываемых ретротранспозонами (мобильными элементами ДНК) и “островками” более сложной ДНК. Все эти элементы нашли в геноме дрозофилы и вне центромер, однако последовательностей ДНК, характерных для каждой центромеры, у них не обнаружили. Значит, сами по себе центромерные последовательности ДНК недостаточны и необязательны для образования центромеры.

Рис. 3. Структура ДНК в центромерах человека и растения.

Прямоугольники соответствуют тандемно организованным мономерам с идентичной последовательностью нуклеотидов внутри (первичная структура ДНК). У разных видов первичная структура ДНК мономеров различается, а вторичная представляет собой спираль. Последовательность мономеров отражает структурную организацию ДНК более высокого уровня.

Это предположение подтверждается и проявлением центромерной активности за пределами нормальных центромер. Такие неоцентромеры ведут себя как обычные центромеры: образуют цитологически различимую перетяжку и формируют кинетохор, связывающий белки. Однако анализ ДНК двух неоцентромер человека и обычной центромеры общих последовательностей не выявил, что говорит о возможной роли других структурных компонентов хромосомы. Ими могут быть гистоновые и негистоновые белки, которые связываются с ДНК, формируя нуклеосомную структуру хроматина.

Функциональную роль центромерной структуры хроматина подтверждает присутствие специфических для каждого биологического вида варианта гистона Н3 в центромерном хроматине: у человека они названы CENP-A, у растений - CENH3. Среди множества имеющихся в кинетохоре белков только два, СЕNН3 и центромерный белок С (СЕNР-С), непосредственно связываются с ДНК. Возможно, именно CENH3, взаимодействуя с другими гистонами (Н2А, Н2В и Н4), формирует и определяет специфический для центромер тип нуклеосом. Такие нуклеосомы могут служить своего рода якорями для образования кинетохора. Варианты гистона Н3 в центромерах различных видов подобны канонической молекуле гистона Н3 в участках взаимодействия с другими гистоновыми белками (Н2А, Н2В, Н4). Однако участок центромерного гистона Н3, взаимодействующий с молекулой ДНК, видимо, находится под действием движущего отбора. Как уже говорилось, первичная структура центромерной ДНК отличается между видами, и было высказано предположение, что центромерный гистон Н3 коэволюционирует вместе с центромерной ДНК, в частности у дрозофилы и арабидопсиса [1].

Обнаружение центромерного гистона Н3 породило крайнюю точку зрения, согласно которой центромерная функция и ее полная независимость от первичной структуры ДНК определяется нуклеосомной организацией и этим гистоном. Но достаточно ли этих факторов для полноценной активности центромеры? Модели, игнорирующие роль первичной структуры ДНК, должны предполагать случайное распределение изменений в структуре центромерной ДНК в различных популяциях в отсутствие отбора. Однако анализ сателлитной ДНК в центромерах человека и Arabidopsis выявил консервативные районы, так же как и районы с более высокой, чем средняя, вариабильностью, что указывает на давление отбора на центромерную ДНК. Кроме того, искусственные центромеры удалось получить только с a-сателлитными повторами человека, амплифицированными из природных центромер, но не из a-сателлитов прицентромерных районов хромосом.

Меньше принципиальных трудностей для объяснения встречают модели, в которых решающим фактором в определении позиции центромеры (сохраняющейся от поколения к поколению) и ее функций служит третичная (или даже более высокого порядка) структура ДНК. Ее консерватизм допускает большие вариации в последовательности нуклеотидов и не исключает тонкую подстройку первичной структуры.

Хеникофф с коллегами [2] предложили модель, описывающую координированную эволюцию ДНК и белков и приводящую к появлению оптимально функционирующих центромер на примере деления женских половых клеток. Как известно, в процессе мейоза одна родительская клетка посредством следующих друг за другом двух делений дает начало четырем дочерним клеткам. Впоследствии только одна из них превращается в зрелую женскую половую клетку (гамету), передающую генетическую информацию следующему поколению, тогда как три других клетки отмирают. Согласно этой модели, в процессе эволюции вследствие мутаций и других механизмов в хромосомах могут возникать центромеры с более протяженными тяжами мономеров сателлитной ДНК или с первичной структурой нуклеотидов, более способствующей связыванию и координированной работе со специфическими формами гистонов CENH3 и СЕNР-С. При этом у одних организмов (арабидопсис, дрозофила) доказательства для положительного давления отбора получены для CENH3, тогда как для других видов (злаки, млекопитающие) для СЕNР-С (рис.4,а). В итоге такие центромеры с усовершенствованным кинетохором становятся “сильнее” и могут присоединять большее число микротрубочек веретена деления (рис.4,б). Если таких “сильных” центромер оказывается в гаметах больше, то происходит процесс мейотического драйва, который увеличивает количество таких центромер, и новый вариант фиксируется в популяции.

Рис. 4. Модель, объясняющая эволюцию центромер.

Вверху - центромеры (серые овалы) содержат специализированный набор белков (кинетохор), включающий гистоны CENH3 (H) и CENP-C (C), которые в свою очередь взаимодействуют с микротрубочками веретена деления (красные линии). В различных таксонах один из этих белков эволюционирует адаптивно и согласованно с дивергенцией первичной структуры ДНК центромер.
Внизу - изменения в первичной структуре или организации центромерной ДНК (темно-серый овал) может создавать более сильные центромеры, что выражается в большем количестве присоединяемых микротрубочек.

Понять механизмы формирования и активности центромерных районов хромосом помогает сравнительная геномика. Уникальный пример разнообразной структуры центромер - хромосома 8 в геноме риса. В ней наряду с сателлитным повтором ДНК и ретротранспозонами обнаружены активно транскрибируемые гены; 48 из них имели последовательности с высокой гомологией к известным белкам [3]. Эти находки опровергают сложившееся на основе изучения центромер человека, дрозофилы и арабидопсиса мнение, что в центромерах нет активно работающих генов.

Если в молекулярной структуре центромер различных видов эукариот присутствуют некоторые универсальные характеристики (организация ДНК в виде тандемных, относительно коротких мономеров и специфические для данных локусов белки хроматина), то в размерах этих районов трудно выявить какие-либо закономерности. Так, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae за минимальную функциональную центромеру принимают участок ДНК в 125 нп, а у дрожжей Schizosaccharomyces pombe она значительно сложнее и длиннее (от 40 до 120 тыс. нп), имеет несколько уровней организации. У человека основной компонент центромер хромосом - a-сателлитная ДНК - образует длинные тяжи тандемно организованных мономеров (от 250 тыс. до 4 млн нп). Среди 12 хромосом риса в хромосоме 8 длина тяжа с сателлитом CentO наименьшая (~64 тыс. нп); в ней определили позицию центромеры и ее примерный размер в 2 млн нп [3]. Удалось получить полную последовательность ДНК этого центромерного района и внутри него определить участок (~750 тыс. нп), где непосредственно формируется кинетохор. В этом районе находится основной кластер CentO.

Удивительная пластичность центромер, в частности активно работающие гены, обнаруженные в центромере хромосомы 8 риса, предполагает отсутствие строгой границы между центромерой и остальной частью хромосомы и даже возможность рассеянной структуры центромерного хроматина. Однако против существования нескольких кластеров в районе хромосомной перетяжки говорят недавно опубликованные данные о наличии хроматинового барьера между собственно центромерой и прицентромерным гетерохроматином у дрожжей Schizosaccharomyces pombe [4]. Барьер представляет собой ген тРНК аланина. Делеция или модификация барьерной последовательности ведет к выходу прицентромерного гетерохроматина за свои обычные границы. Более того, отсутствие барьера вызывает ненормальное расхождение хромосом в мейозе. Безусловно, следует помнить, что эти интереснейшие результаты касаются пока только одного вида дрожжей.

Теломеры

Термин “теломера” предложил Г.Мёллер еще в 1932 г. [5]. В его представлении она означала не только физический конец хромосомы, но и присутствие “терминального гена со специальной функцией запечатывания (пломбирования) хромосомы”, которое делало ее недоступной для вредных воздействий (хромосомных перестроек, делеций, действия нуклеаз и т.д.). Наличие терминального гена не подтвердилось в последующих исследованиях, однако функция теломеры была определена точно.

Позднее выявили еще одну функцию. Так как на концах хромосом обычный механизм репликации не работает, в клетке есть другой путь, поддерживающий стабильные размеры хромосом при клеточном делении. Эту роль выполняет специальный фермент, теломераза, которая действует подобно другому ферменту, обратной транскриптазе: использует одноцепочечную РНК-матрицу для синтеза второй цепи и восстановления концов хромосом. Таким образом, теломеры во всех организмах выполняют две важные задачи: защищают концы хромосом и поддерживают их длину и целостность.

Первые работы по определению природы ДНК теломер выявили тандемную организацию коротких мономеров у широкого спектра организмов (простейших, грибов, насекомых, растений и млекопитающих [6]), что вполне соответствовало универсальному характеру функций теломеры. Еще одна консервативная особенность теломерной ДНК - наличие относительно короткого одноцепочечного “хвоста”, состоящего из G-остатков с ориентацией 5’-3’ G-богатой цепи вперед к концу хромосомы. Считают, что такой выступ обеспечивает связывание теломер-специфических белков, образующих “колпак” (cap) для защиты конца хромосомы.

Однако по мере расширения изучаемых видов оказалось, что существуют альтернативные пути удлинения концов хромосом и их защита не зависит от короткого канонического повтора. Например, у Drosophila melanogaster ДНК теломер состоят из тандемных тяжей, образовавшихся в результате последовательных транспозиций ретротранспозонов, а одноцепочечных G-выступов пока не обнаружено. Несмотря на столь существенные различия в природе ДНК двух типов теломер, они имеют много общего. Например, и те, и другие поддерживают свою длину с помощью обратной транскрипции с РНК-матрицы и могут использовать для этой цели рекомбинацию (обмен генетическим материалом).

Список организмов, теломеры которых не имеют консенсусной последовательности, продолжает расширяться и сегодня включает некоторые виды из четырех отрядов насекомых: Diptera, Coleoptera, Heteroptera и Dermaptera. У комаров (Diptera) отмечен третий тип теломер: их ДНК представлена длинным тяжем регулярного тандемного повтора длиной 340 нп. Вероятно, здесь размеры поддерживаются подобно уже описанному механизму для первых двух типов, т.е. регенерация сложных повторов может происходить с помощью рекомбинации или опять-таки обратной транскрипцией РНК, продуцируемой с теломеры. Среди растений также описаны виды родов луковых и алое, не имеющих консенсусного теломерного повтора, TTTAGGG. Таким образом, подобно рассмотренным выше центромерам, теломеры выполняют исключительно важные и консервативные функции и имеют удивительно пластичную структурную организацию ДНК.

Как и у центромер, для разных видов размеры теломер и их частей сильно отличаются. У более чем 80% хромосом человека G-выступы имеют длину более 200 нп, тогда как у некоторых хромосом видов растений Silene latifolia и Arabidopsis thaliana они могут вообще отсутствовать. Этот факт вызывает некоторые сомнения в необходимости G-выступов для выполнения теломерных функций. Размер другого субдомена теломеры - участка двухцепочечной ДНК теломерного повтора - варьирует в еще большей степени между видами, колеблясь от 20 нп у Oxytricha до более чем 100 тыс. нп у лабораторных линий мышей, табака, пшеницы [6]. Мы сравнили размеры теломер у некоторых видов злаков - пшеницы, ячменя и ржи, принадлежащих к эволюционно близким родам одной трибы Triticeae. Существенные различия в размерах обнаружены между короткими теломерами ржи (8-50 тыс. нп) и длинными теломерами пшеницы (до 175 тыс. нп).

Согласно многим исследованиям, размер теломеры может колебаться при стрессовых воздействиях, укорачиваться при старении и онкогенезе. Вместе с тем другие работы демонстрируют относительное постоянство размеров теломеры у каждого конкретного вида, что указывает на функционирование регуляторного механизма, контролирующего теломеразу так, чтобы ее активность ограничивалась только компенсацией репликационных потерь теломерной ДНК. Следует отметить, что все приведенные количественные оценки носят относительный характер. Несмотря на это, можно определенно утверждать, что размеры теломер и центромер как среди различных видов эукариот, даже эволюционно близких, так и между различными хромосомами одного кариотипа характеризуются высокой гетерогенностью. В связи с этим возникает вопрос, а существует ли четкая, обусловленная различиями в молекулярной структуре граница, отделяющая эти районы от остальной хромосомы?

Анализ имеющихся данных показывает, что в случае теломер о существовании такой границы говорить трудно, если вообще возможно. Неясно, что считать настоящей (истинной) теломерой. Наиболее популярная точка зрения рассматривает в качестве теломеры весь тяж последовательности ДНК теломерного повтора вместе с многочисленными белками, связывающимися как с одно-, так и с двухцепочечной ДНК. Однако у многих видов эукариот (особенно если геномы большого размера) переход между тяжом теломерного повтора и субтеломерой характеризуется появлением мономеров с вырожденной структурой классического повтора и заканчивается копиями дегенеративных повторов с более чем одной нуклеотидной заменой. Более того, сам тяж теломерного повтора представляет собой отнюдь не такую гомогенную структуру, как было принято думать.

Мы с помощью флуоресцентной in situ гибридизации теломерного повтора на фибриллах ДНК показали, что наряду с гомогенными флуоресцирующими треками сигнала гибридизации присутствуют треки с разрывами, в которых, вероятно, помимо теломерного повтора находятся другие типы последовательностей ДНК (рис.5). Мы также обнаружили фибриллы с рассеянными одиночными сигналами теломерного повтора. Таким образом, теломерные повторы не всегда организованы как монотонные гомогенные тяжи мономеров. Они могут прерываться другими последовательностями ДНК и рассеиваться в виде коротких кластеров. Такая гетерогенная организация может приводить к завышенным количественным оценкам длины теломер и, кроме того, к неадекватной оценке участия соседних последовательностей в вариации размеров теломер.

Рис. 5. Гибридизация пробы ДНК на растянутых фибриллах ржи.
Различные типы организации теломерного повтора: монотонные треки (вверху)
и треки с разрывами (спейсерами) различных размеров (в середине и внизу).

Теломерные повторы могут располагаться вдоль плеч в интерстициальных и даже в прицентромерных районах хромосом, но сами по себе не образуют функциональную теломеру. Вполне логично думать, что для ее формирования необходимы специализированные белки, обволакивающие теломерную ДНК и защищающие концы хромосомы от нежелательных воздействий. Теломерную ДНК можно рассматривать как платформу для сборки больших комплексов белков, ключевой среди которых - комплекс теломеразы. Кроме того, в реализации ее функций участвуют другие системы: ДНК-белковый комплекс, формирующийся на одноцепочечном G-выступе, и белковые комплексы на двухцепочечной ДНК теломерного повтора. Некоторые белки специфически локализованы на теломерах, но основная их часть присутствует и в других участках хромосом.

Предложена модель белкового комплекса из шести теломер-специфических белков, формирующегося на теломерах хромосом человека [7]. ДНК образует t-петлю, а одноцепочечный выступ внедряется в двухцепочечный участок ДНК, расположенный дистально (рис.6). Белковый комплекс позволяет клеткам отличать теломеры от мест разрыва хромосом (ДНК). Не все белки теломер входят в состав комплекса, который избыточен на теломерах, но отсутствует в других районах хромосом. Защитные свойства комплекса вытекают из его способности воздействовать на структуру теломерной ДНК по крайней мере тремя способами: определять структуру самого кончика теломеры; участвовать в образовании t-петли; контролировать синтез теломерной ДНК теломеразой. Родственные комплексы найдены и на теломерах некоторых других видов эукариот.

Рис. 6. Модель образования t-петлевой структуры на конце хромосомы.

Вверху - теломера в момент репликации хромосомы, когда ее конец доступен для комплекса теломеразы, который осуществляет репликацию (удвоение цепи ДНК на самом кончике хромосомы). После репликации теломерная ДНК (черные линии) вместе с находящимися на ней белками (показаны разноцветными овалами) образует t-петлю (нижняя часть рисунка).

Простые последовательности ДНК - сложные функции

Итак, у подавляющего большинства организмов основной тип последовательностей ДНК в центромерных и теломерных районах - это тандемно организованные мономеры короткой длины. Очевидно, что столь короткие последовательности (особенно в теломерах) обладают крайне ограниченной кодирующей способностью в первичной структуре и не соответствуют концепции Мёллера о терминальном гене [5].

В последние годы стало очевидным, что универсальных последовательностей ДНК, непосредственно определяющих функции центромер и теломер, нет. В этих районах хромосом ДНК служит платформой для сборки сложных, многокомпонентных ДНК-белковых комплексов, которые и обеспечивают выполнение этих функций. Более подробно о комплементарной организации этих комплексов и их координированного функционирования можно прочитать в нашем обзоре [2]. Наряду со специфическими для центромер и теломер компонентами этих комплексов в их состав входят и такие, которые участвуют в выполнении нескольких функций, иногда даже противоположных. Например, Ku70/80-гетеродимер входит в состав теломер и работает как позитивный регулятор длины теломер у дрожжей и негативный регулятор - у растения арабидопсис. В тоже время этот белок участвует в распознавании разрывов хромосом и их восстановлении. Без сомнения, одно из наиболее актуальных направлений исследований - выявление молекулярной природы механизмов регуляции разнообразных молекулярных комплексов, обеспечивающих активность центромер и теломер.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 04-04-48813), INTAS (03-51-5908)
и Программы интеграционных проектов СО РАН (проект 45/2).

Литература

1. Talbert P.B., Bryson T.D., Henikoff S. // J. Biol. 2004. V.3. Article 18.

2. Вершинин А.В. // Генетика. 2006. V.42. P.1200-1214.

3. Wu J., Yamagata H., Hayashi-Tsugane M. et al. // Plant Cell. 2004. V.16. P.967-976.

4. Scott K.C., Merrett S.L., Willard H.F. // Curr. Biol. 2006. V.16. P.119-129.

5. Muller H.J. Further studies on the nature and causes of gene mutations // Proc. Sixth Int. Congr. Genet. 1932. V.1. P.213-255.

6. Louis E.J., Vershinin A.V. // BioEssays. 2005. V.27. P.685-697.

7. Lange T.de // Genes Dev. 2005. V.19. P.2100-2110.