VIVOS VOCO: Е.В. Пименов, В.В. Кожухов, Ю.И. Строчков, "Создание вакцин против сибирской язвы"

Создание вакцин против сибирской язвы

Е.В. Пименов, В.В. Кожухов, Ю.И. Строчков

Евгений Васильевич Пименов, вице-президент Академии медико-технических наук, начальник Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны России. Лауреат Государственной премии СССР и премии Правительства Российской Федерации. Область научных интересов — биологическая защита войск и населения, биотехнология, генная инженерия.
Владимир Васильевич Кожухов, доктор медицинских наук, начальник отдела сибиреязвенных вакцин того же института. Лауреат премии Правительства РФ. Научные интересы связаны с биотехнологией и промышленным производством иммунобиологических препаратов для защиты от особо опасных инфекций. Монография — “Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики” (в соавторстве с Г.Г.Онищенко, Н.Т.Васильевым, Н.В.Литусовым и др.; М., 1999).
Юрий Иванович Строчков, начальник лаборатории генетики и селекции споровых форм микроорганизмов того же института. Занимается генной инженерией и молекулярной биологией.

О сибирской язве, которая относится к числу особо опасных инфекций, наслышаны, видимо, многие. Эта болезнь, поражающая сельскохозяйственных животных — крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов, — все еще остается бичом для многих стран и приносит большой экономический ущерб. Болеют ею и дикие млекопитающие (травоядные, хищные, а также всеядные кабаны). Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен больше 100 лет сохраняться в почве в виде спор и образовывать стойкие очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе на территории России, создает постоянную угрозу эпизоотий и эпидемических вспышек среди людей, которым инфекция передается от скота. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире ежегодно заболевают около 20 тыс. человек, нередок даже летальный исход.

В России количество выявленных очагов насчитывает более 72 тыс., но есть и такие, которые далеко не всегда поддаются учету. Это, например, скотомогильники. Именно из них, по данным ряда исследователей, в последние годы возросло поступление возбудителя сибирской язвы в природную среду. В настоящее время отмечается активизация многих очагов, и Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора (Госкомсанэпиднадзор) оценивает эпидемическую обстановку по сибирской язве как напряженную.

Как предотвратить эту болезнь? Соблюдением одних санитарных норм не обойтись, поэтому для профилактики используются вакцины. В нашей стране до недавнего времени применяли живые споры ослабленных штаммов возбудителя, за рубежом — в основном химическую вакцину. Однако, хотя такая профилактика дает надежный эффект, вакцинные препараты продолжают совершенствоваться. О современных подходах к их созданию и пойдет речь в статье. Но начнем с самого возбудителя.

Бацилла и ее оружие

Сибиреязвенная бацилла (Bacillus anthracis) — это крупная (длиной 6—10 мкм и диаметром 1—1.5 мкм) аэробная грамположительная неподвижная палочка. Она может существовать в двух формах — вегетативной и покоящейся. Вегетативная клетка окружена капсулой и одета плотной оболочкой, под которой находится цитоплазматическая мембрана, а внутри цитоплазмы — нуклеоид (аналог ядра, генетический аппарат) и рибосомы. Размножается эта форма простым поперечным делением, но дочерние клетки не расходятся, а остаются соединенными. При дальнейших делениях образуется цепочка из нескольких вегетативных клеток, каждая из которых заключена в капсулу. Внутри клеток такой колонии и формируется покоящаяся форма бациллы — спора. Схематически это происходит следующим образом. Сначала удваивается и делится пополам нуклеоид, каждый новый аналог ядра перемещается к полюсу клетки, а внутри ее возникает поперечная перетяжка из цитоплазматической мембраны. Затем около одного из полюсов мембрана впячивается и обволакивает нуклеоид. Образуется проспора, окруженная двойной мембраной. На этой стадии бацилла представляет собой своеобразный двуклеточный организм — материнскую клетку с проспорой внутри. Постепенно она превращается в зрелую спору, защищенную от внешних воздействий кортексом и мощной оболочкой. После этого материнская клетка разрушается и спора освобождается. В благоприятных условиях она прорастает — сбрасывает “защитную одежду” и становится вегетативной клеткой.

Одиночные вегетативные клетки сибиреязвенной бактерии. Каждая клетка заключена в плотную оболочку, называемую клеточной стенкой, под которой находится цитоплазматическая мембрана. Большую часть объема клетки занимает бактериальный аналог ядра эвкариотических организмов — нуклеоид, содержащий генетический материал.

Цепочки вегетативных клеток. Такие колонии хорошо заметны в поле зрения светового микроскопа (слева).
На микроэлектронной фотографии (справа) видны споры, созревающие внутри каждой бактериальной клетки.
Зрелая спора, показанная на врезке, снаружи покрыта трехслойной оболочкой, а под ней залегает еще один защитный слой — кортекс.

В организм млекопитающего, и человека в том числе, она попадает контактным путем. Животные в течение всей болезни выделяют бациллу с мочой, фекалиями, мокротой, слюной, молоком, поэтому заразны не только продукты животноводства, но и предметы ухода за скотом, навоз. Человек может заразиться, соприкасаясь с больным животным или его трупом, при убое, разделке туши, кулинарной обработке мяса, манипуляциях с обсемененным возбудителем сырьем (кожей, овчиной, шерстью) и изделиями из него, нарушении режима работы в лаборатории. Известны случаи, когда бацилла попадала в организм с пищей, через укусы слепней и мух-жигалок, воздушно-пылевым путем во время обработки шерсти на овчинно-шубных производствах. Возбудитель способен проникать в организм человека через повреждения кожных покровов, и тогда развивается кожная форма болезни (видимо, из-за этой формы сибирская язва известна и под другим названием — злокачественный карбункул). Если “воротами инфекции” служат слизистые оболочки, кишечный тракт или дыхательные пути, болезнь принимает более опасную форму — висцеральную. Протекает она тяжело и скоротечно, может развиться сепсис, за которым в 13% случаев следует смерть.

В окружающей среде бактерия находится, как упоминалось, в виде спор (они могут созревать еще в кишечнике больного животного), высокоустойчивых к колебаниям температуры, влажности, давлению, инсоляции и т.д. и потому сохраняющих жизнеспособность длительное время. Если условия в почве благоприятны, споры даже прорастают, приводя к накоплению возбудителя.

В организм диких и домашних животных могут попасть споры, которые тоже прорастают, и образуется вегетативная форма. В таком виде B.anthracis и существует в тканях, и передается от больного к здоровому. Достаточно небольшого числа спор или вегетативных клеток, попавших тем или иным способом в организм, чтобы бактерия размножилась в тканевой жидкости и макрофагах. А затем в ход пускается специфическое оружие, которым сибиреязвенный микроб поражает клетку, — экзотоксин (т.е. выделяемый бациллой токсин) и капсульная субстанция. Дополнительно к ним бактерия продуцирует еще и экзопротеазы — ферменты, расщепляющие белки макроорганизма.

Экзотоксин представляет собой белковую молекулу, состоящую из трех субъединиц: протективного антигена, отечного и летального факторов (названия даны по характеру действия на лабораторных животных, а слово “фактор” соответствует термину “субъединица”). В молекуле токсина протективный антиген играет транспортную роль: сначала соединяется со специфическим клеточным рецептором, потом активируется за счет гидролиза и в результате обретает способность образовывать мембранные каналы, чем и обеспечивает перенос двух других субъединиц — отечного и летального факторов — в клетку организма-хозяина. Там эти, по сути самостоятельные, токсины и осуществляют свое цитотоксическое действие: вместе с экзопротеазами вызывают резкие нарушения клеточного обмена, приводя к деградации и гибели клетки. В организме больного протективный антиген выполняет защитную функцию, так как в ответ на его введение образуются антитела, которые предотвращают последующее заражение высоковирулентными штаммами бактерии.

Для проявления агрессивности микроба в организме очень существенна капсульная субстанция, которая представляет собой полимер D-глутаминовой кислоты. Именно капсула ингибирует фагоцитоз, предотвращая гибель бациллы, защищает от бактерицидного действия лимфы и крови макроорганизма.

Многочисленными наблюдениями убедительно показано, что вирулентность возбудителя сибирской язвы, утратившего способность образовывать капсулу, снижается в десятки тысяч раз, хотя его свойства вызывать иммунитет (т.е. иммуногенные) сохраняются. Этот феномен послужил основой для разработки в конце 30 — начале 40-х годов живых споровых вакцин на основе штаммов, не имеющих капсулы, но вырабатывающих токсин.

Схема строения плазмид pXO1 и pXO2.

Гены первой плазмиды в основном ответственны за синтез субъединиц экзотоксина: отечного фактора (ген cya), протективного антигена (pag) и летального фактора (lef). Во второй плазмиде содержится целый кластер генов (capA, capC и capB), обеспечивающих образование капсулы, т.е. полимеризацию D-глутаминовой кислоты. Из других плазмидных генов на схеме показано положение только тех, которые управляют синтезом. В pXO1 — это положительный регулятор синтеза экзотоксина (atxA), отрицательный регулятор синтеза протективного антигена (pagR) и группа генов, обеспечивающих прорастание спор (ger); в pXO2 — положительный регулятор синтеза D-глутаминовой кислоты (acpA) и дублированный (atxA), а также ген, ограничивающий полимеризацию капсульной субстанции (dep). На схеме соблюдена размерная пропорция генов и их расположение в кольцевой структуре каждой плазмиды.

Генетический аппарат сибиреязвенного микроба состоит из хромосомы и двух плазмид (pXO1 и рХО2), очень важных для вирулентности и иммуногенности внехромосомных элементов, открытых в начале 80-х годов. Плазмида рХО1 содержит три токсиновых гена — pag, lef и cya. Первый из них кодирует синтез протективного антигена, второй — летального фактора, третий — отечного фактора. Имеются также гены регуляторов синтеза этих продуктов. В плазмиде рХО2 наиболее значимы гены, определяющие синтез капсулы. К настоящему времени полностью расшифрована нуклеотидная последовательность первой плазмиды и значительная часть второй. Благодаря этому существенно расширились возможности генетических манипуляций с бациллой.

В генетическом отношении она оказалась одним из наиболее однородных микроорганизмов, что во многом связано со способностью бациллы образовывать споры. Различия между ее штаммами сводятся к наличию или отсутствию плазмид или вариабельности их структуры.

Современная защита

Чтобы предотвратить развитие в организме млекопитающего сибиреязвенной бактерии, сейчас используют вакцины четырех типов: живую, химическую (молекулярную), комбинированную и рекомбинантную.

Живая вакцина — это лиофильно высушенные споры эталонного, специально выращенного, штамма B.anthracis. Химическая вакцина кардинально отличается от живой тем, что представляет собой сорбированный на носителе протективный антиген (т.е. одну лишь белковую молекулу, отсюда и другое название вакцины — молекулярная), который получают в процессе культивирования вакцинного штамма. Обе вакцины обеспечивают формирование как гуморального, так и клеточного иммунитета, но химический препарат вызывает иммунный ответ быстрее (через несколько дней), однако гуморальная защита быстро угасает. Комбинированные вакцины готовят на основе спор и протективного антигена, а рекомбинантные конструируют генноинженерной технологией — встраиванием фрагментов ДНК, способных вызывать иммунный ответ макроорганизма, в генетический аппарат того или иного вектора (других, подходящих для этого бактерий).

В СССР противоязвенным профилактическим средством служила живая вакцина, которую готовили в Грузии. После распада Союза поставки в Россию прекратились, и в 1990—1993 гг. отечественная вакцина практически не производилась, нечем было проводить плановые ревакцинации. По данным Госсанэпиднадзора, число заболеваний сибирской язвой среди людей в 1992—1993 гг. увеличилось по сравнению с таковым в конце 80-х в два раза. Необходимость в разработке и внедрении профилактических средств стала острейшей.

Надо сказать, что основы для их создания уже существовали: например, еще в 80-х годах в бывшем Свердловске, в Центре научно-технических проблем биологической защиты Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны, была разработана жидкая комбинированная вакцина. Занимались сибиреязвенной вакциной и в нашем институте. В результате, в 90-х годах была создана не имеющая аналогов сухая форма комбинированной вакцины, состоящей из живых спор ослабленного штамма и протективного антигена, сорбированного на геле гидроксида алюминия [1].

Выяснилось, что защитный эффект комбинированной вакцины, по сравнению с живой, сильнее, причем иммунитет не только развивается быстрее (преимущественно за счет протективного антигена), но и дольше сохраняется благодаря персистенции (сохранению) в организме клеток ослабленного штамма бактерии. Показатели же безвредности и реактогенности (способности вызывать местные и общие реакции макроорганизма) этих вакцин существенно не отличаются и соответствуют медико-биологическим требованиям.

Сравнение отечественных комбинированных вакцин — жидкой и сухой — с американской химической тоже не в пользу последней. И по многим характеристикам, в первую очередь — по длительности специфической резистентности, а также кратности первичной иммунизации и срокам ревакцинации. Чтобы создать устойчивый иммунитет, используя химическую вакцину, нужна длительная многократная иммунизация, а это чревато возникновением аллергической реакции. Кроме того, такая вакцина, по мнению американских исследователей, защищает не от всех вирулентных штаммов B.anthracis. Например, трехкратным введением химической вакцины только у 17—33% подопытных морских свинок развивается иммунитет против любого из четырех штаммов (Ames, NH, FCB, SK162), в то время как живая споровая вакцина обеспечивает 100%-ю защиту. Есть и другие преимущества отечественных комбинированных вакцин, важные для медицинской практики, — больший срок годности, менее жесткие условия хранения и транспортировки.

Эти вакцины уже лицензированы, нашим институтом получены сертификаты на производство и живой, и комбинированной сибиреязвенных вакцин.

Благодаря внедрению новых технологий получения эталонных культур B.anthracis, ее выращивания, концентрирования и высушивания удалось существенно снизить энергоемкость производства и многократно повысить производительность отдельных его участков. Качество эталонного штамма и вакцинного препарата, в сравнении с тем, что выпускался Тбилисским научно-производственным объединением, по иммуногенности и стабильности основных свойств в течение ряда лет повысилось в 5—10 раз. Создатели новой технологии серийного производства вакцины в 1998 г. удостоены Премии Правительства РФ.

С конца 1993 г. произведено 25 млн доз вакцины, потребности в ней отечественных медицинских учреждений полностью обеспечены (им поставлено более 200 тыс. комплектов). В результате иммунизации нашей вакциной в середине 90-х годов снизился уровень заболеваемости людей: по данным Госкомсанэпиднадзора, в 1994 г., по сравнению с 1992 г., число заболевших уменьшилось примерно на 46%, а в 1995-м — еще на 23% от количества больных в 1994 г.

Сроки возникновения и сохранения иммунитета, развивающегося у лабораторных животных при введении сибиреязвенных вакцин. Защитный эффект рассчитан как относительное количество выживших животных, которых после иммунизации заражали 100 дозами ЛД₅₀ возбудителя.
Верхняя кривая - сухая комбинированная вакцина, средняя - живая, нижняя "острая" - химическая.

Заболеваемость людей сибирской язвой в России в 1992—1997 гг. и количество доз (х100 тыс.) вакцины, произведенной в эти же годы (цветные столбики).

Прототипы вакцин будущего

Несмотря на эффективность существующих сибиреязвенных вакцин, специалисты ищут способы усовершенствования этих профилактических средств. Цель поисков — увеличить длительность иммунитета, повысить уровень продукции протективного антигена, обеспечить менее выраженные общие (например повышение температуры) и местные реакции, возникающие в ответ на действие летального и отечного факторов. Достичь таких результатов можно методами генетической инженерии, т.е. манипулируя генами плазмиды рХО1 (pag, lef и cya) и плазмиды pXO2.

Исследования ведутся в ряде лабораторий мира в нескольких направлениях. Одно из них — конструирование рекомбинантных штаммов, продуцирующих протективный антиген. Для этого ген pag внедряют в геном других микроорганизмов — Bacillus subtilis или B.brevis, часто используемых в биотехнологии бактерий, и те синтезируют защитный антиген, причем больше, чем сама сибиреязвенная бацилла. Судя по результатам экспериментов, иммунизация полученными таким способом рекомбинантными штаммами защищает морских свинок от заражения вирулентными спорами B.anthracis [2]. Однако исследователям пока не удалось добиться устойчивого результата, так как чужеродная для этих бацилл ДНК сибиреязвенной бактерии далеко не всегда сохраняет свою устойчивость.

По мнению некоторых исследователей, предпочтительнее конструировать штаммы-продуценты, которые синтезировали бы не полную субъединицу протективного антигена, а только его небольшие гидрофильные фрагменты — эпитопы иммуногенности (участки молекулы, которые взаимодействуют с антителом и обеспечивают клеточный иммунитет). Чтобы создать такие штаммы, в геном бактерии-вектора необходимо вставить лишь ту часть гена pag, которая кодирует эти эпитопы. Но именно она-то и считается наиболее изменчивой у разных вакцинных штаммов B.anthracis.

В наших исследованиях, однако, такая закономерность не выявлена. Мы специально определили последовательность около 800 нуклеотидов в теоретически наиболее вариабельном гидрофильном участке гена pag трех вакцинных штаммов (СТИ-1, 55 и второй вакцины Ценковского) и обнаружили всего две замены, которыми они отличаются от известной последовательности штамма Sterne. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что ген pag весьма консервативен, и его изменчивостью при разработке рекомбинантных вакцин можно пренебречь [3].

Некоторые исследователи предлагают повысить иммуногенность сибиреязвенных вакцинных штаммов введением в них дополнительных, чужеродных генетических фрагментов, например гена стафилококкового белка А. Однако экспериментаторы столкнулись с двумя весьма существенными недостатками: подобные варианты вызывают аллергические реакции, а сами штаммы-продуценты генетически нестабильны.

Известно, что химические вакцины обеспечивают защиту не от всех штаммов B.anthracis, а перенесенная инфекция дает стойкий иммунитет. Исходя из этого, некоторые специалисты предлагают создавать более иммуногенные рекомбинантные вакцины на основе B.subtilis с детерминантами, кодирующими капсульные полипептиды.

Второе направление в совершенствовании вакцин против сибирской язвы предусматривает создание рекомбинантных штаммов, которые вызывали бы длительный иммунитет. Для этого пригодны вакцинные штаммы возбудителей особо опасных инфекций, способные долго сохраняться в организме и тем самым поддерживать стойкий иммунитет. Если в такие штаммы ввести ген протективного антигена, цель будет достигнута. Это перспективное направление позволит создать поливалентные вакцины, т.е. профилактические средства сразу против нескольких особо опасных инфекций. В последние годы удалось внедрить ген pag в разные штаммы лактобацилл, обладающих адъювантными (усиливающими иммунный ответ) свойствами, а значит, появилась возможность создавать вакцины для перорального применения.

Третье направление в повышении эффективности сибиреязвенных вакцин основывается на применении новых адъювантных технологий, белковой инженерии и иммуномодуляции. Для этого пригодны вакцинные препараты, лишенные балластных веществ (т.е. всего того, что не имеет отношения к выработке иммунитета). Повышение иммуногенности достигается традиционными путями, без генетической инженерии: за счет укрупнения, полимеризации, молекул антигена, закрепления его на минеральном сорбенте (например, гидроксиде алюминия) или синтетическом полимерном. Известно, что сорбенты повышают иммуногенность белковых антигенов в десятки и сотни раз. Иными словами, речь идет об адъювантных, сорбированных препаратах, или, как их иногда называют, полусинтетических вакцинах. Роль протективного антигена в них — вызывать иммунный ответ, функция носителя — усиливать иммунитет. Очень эффективную вакцину создали Б.Ивинс с коллегами для пероральной профилактики свиней, заразившихся спорами B.anthracis [4]. Она состоит из протективного антигена и адъювантов — сапонина QS-21 и монофосфориллипида А в эмульсии поверхностно-активного вещества твина-80. В экспериментах этот препарат проявил себя много лучше, чем используемые в таких случаях английская или американская вакцины.

Надо сказать, что получение протективного антигена в процессе культивирования производящих его бактерий связано с одной неприятностью. Будучи белковой молекулой, антиген разрушается ферментами протеазами, и, следовательно, выработка его бактериями снижается. Этого можно избежать, если модифицировать антиген методами белковой инженерии — удалить из молекулы те участки, по которым его расщепляют протеазы.

Что же касается полимеризации протективного антигена, то ее пытаются добиться дупликацией иммунологически значимых эпитопов или модификацией антигена, которая приводила бы к образованию нескольких этих фрагментов с формированием ими четвертичной структуры. Такие молекулы протективного антигена, насыщенные важными для иммунитета участками, стимулируют выработку антител и усиливают защитные свойства вакцин.

В настоящее время экспериментально доказана возможность повысить эффективность и живых сибиреязвенных вакцин, если вторичную иммунизацию проводить препаратами, которые содержат протективный антиген и усиливающие иммунный ответ организма иммуномодуляторы, например сальмозан.

В последние годы в ряде лабораторий разрабатывается четвертое направление в создании сибиреязвенных вакцин. Основано оно на конструировании штаммов возбудителя со структурно измененными генами токсинов. Исходными вариантами служат штаммы B.anthracis только с одной плазмидой — pXO1, и из генов lef и cya удаляют определенные участки. В результате цитотоксическая активность бактерии сильно снижается, но преимущества живых вакцин сохраняются. Есть и другая возможность — найти среди сибиреязвенных штаммов варианты без этих генов, для чего анализируют ДНК клонов бактерий с помощью полимеразной цепной реакции.

Недавно в нашем институте закончено исследование по влиянию индуцированных мутаций в генах pag и lef на иммуногенность и остаточную вирулентность вакцинных штаммов [5]. Выяснилось, что лишь обширное повреждение в концевой части гена pag приводит к потере биологических свойств, а отсутствие примерно 600 пар нуклеотидов не сказывается никак. В то же время сравнительно небольшая утрата нуклеотидов (около 150 пар) в центральной области гена значительно снижает иммуногенность штамма. Если же дефектен ген lef, а pag не изменен, то вирулентность существенно снижается, но иммуногенность сохраняется (или уменьшается незначительно). Так что поиск вариантов сибиреязвенной бациллы с дефектными генами токсинов отнюдь не бесполезен.

К середине 90-х годов сформировалось пятое направление — ДНК-вакцинация [6]. Этот принципиально новый подход основан на способности нуклеиновых кислот существовать несколько недель и даже месяцев в цитоплазме клеток организма-хозяина, не встраиваясь в его геном, но поддерживая синтез закодированных белков. Следовательно, если в профилактических целях иммунизировать человека, скажем, фрагментом гена pag, то под контролем человеческого промотора (участка ДНК, содержащего старт-сигнал для синтеза мРНК) будет синтезироваться эпитоп протективного антигена, который и вызовет иммунный ответ. Такая вакцинация может быть особенно предпочтительна для людей, страдающих аллергией.

С ДНК-вакцинацией, развивающейся огромными темпами, связывают надежды на профилактику и лечение многих заболеваний, в том числе и особо опасных инфекций. Сегодня экспериментально подтверждена ее эффективность в создании полноценного иммунитета не только к вирусам гепатита, гриппа и др., но и возбудителям сальмонеллеза, туберкулеза, коклюша, а также сибирской язвы. Некоторые ДНК-вакцины уже проходят клинические испытания. Все это позволяет утверждать, что одним из главных направлений развития медицины XXI в. станет вакцинация генами.

Специалисты разного профиля продолжают поиск по созданию безопасных и высокоиммунных сибиреязвенных вакцин. Видимо, уже в ближайшие годы станет ясно, какое из развивающихся направлений даст лучшие результаты и позволит предотвратить эпизоотии и распространение сибирской язвы среди людей.

Литература

1 Anisimova T.I., Pimenov E.V., Kozhukhov V.V. et al. // Abst. Intern. Workshop on Anthrax. Winchester (England), 1995. P.108.

2 Anthrax. Winchester (England), 1995.

3 Зубов В.В., Кожухов В.В., Алиев Т.К. и др. // Материалы научн.-практ. конф., посвященной 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997. Т.2. С.53.

4 Ivins B., Fellows P., Pitt L. et al. // Vaccine. 1995. V.13. №8. P.1779—1784.

5 Kozhukhov V.V., Pimenov E.V., Vasilyev N.T. et al. // Abst. 3th Intern. Conf. on Anthrax. Plymouth, 1998. P.87.

6 Подробнее об этом см., напр.: Дебабов В.Г. // Молекуляр. биология. 1997. Т.316. С.269—275.