Рост числа больных туберкулезом в последние пять-шесть лет во всем мире — развивающихся странах, у нас в России и даже на благополучном Западе — стимулировал научно-исследовательские работы по изучению генетических структур возбудителя и полному определению нуклеотидной последовательности его генома (секвенированию). Сегодня можно считать, что туберкулезная палочка (палочка Коха) — один из самых изученных микроорганизмов, у которого полностью составлена генетическая карта и прочитан весь геном. Казалось бы, о структуре бактериальной клетки все уже известно, постигнута основа основ: имеется информация о размерах генома, его отличительных особенностях по сравнению с другими патогенными для человека микроорганизмами и даже — о каждом гене клетки. Но вспомним, что прошло более 15 лет с тех пор, как была закончена и опубликована полная нуклеотидная последовательность всего генома ВИЧ, однако до сих пор нет эффективного средства защиты от этого вируса и лечения. Возможно, такое сравнение не совсем корректно в научно-методическом плане — но ведь полный геном туберкулеза человека в сотни раз больше генома ВИЧ, и соответственно во столько же раз больше потребовалось материальных и научных затрат для определения нуклеотидной последовательности и структуры всего генома туберкулезной клетки. Динамика заболеваемости туберкулезом в России (вверху — всего населения, в середине — детей) и смертности от него.

Возвращаясь к названию статьи, спросим все-таки, почему туберкулез проблема не только социальная? Ведь давно известно, что эта болезнь связана с условиями жизни человека: чем он хуже живет — недоедает, недосыпает, изнурен тяжелым физическим трудом, постоянно находится под воздействием профессиональных вредных веществ, «пыли» и т.д. — тем выше заболеваемость. Но почему наметился рост заболеваемости туберкулезом на благополучном Западе и даже в скандинавских странах? Почему в конце концов в последние несколько лет Москва стала признанной столицей чахотки? Об этом говорят данные Московского центра по борьбе с туберкулезом:

• ежегодно инфицируются более 9 тыс. детей (это на порядок (!) выше, чем в любой развитой стране мира); детская заболеваемость в 1998 г. по сравнению с предыдущим годом увеличилась с 4.9 до 6.2 на 100 тыс. детей, т.е. на 26.5%;
• общая заболеваемость всего населения столицы, включая беженцев, мигрантов и др., в 1998 г. составила 47,9 на 100 тыс.населения, т.е. за один год выросла на 6.9%;
• в 1998 г. от туберкулеза умерло 825 человек.

В России, по данным Центрального научно-исследовательского института туберкулеза, в 1997 г. число больных туберкулезом увеличилось по сравнению с 1991 г. более чем в два раза (с 50407 до 108166 человек), среди них зарегистрировано 4377 детей (Пунга В.В., Капков Л.П. // Проблемы туберкулеза, 1999. №1. С. 14—16).

По данным ВОЗ, туберкулезом инфицирована одна треть жителей нашей планеты. Ожидается, что к 2010 г. будет около 1 млрд вновь инфицированных, более 200 млн заболевших, а 70 млн умрет от этой болезни. К сожалению, таковы печальная статистика и не менее пессимистический прогноз. Однако не надо забывать, что впечатляющие успехи в научных разработках по молекулярной биологии туберкулеза могут быть реально использованы для точной диагностики и производства более эффективных вакцин и новых лечебных средств.

Особенности строения и функционирования возбудителя туберкулеза

В конце 1998 г. усилиями огромного коллектива молекулярных биологов из Великобритании, США, Франции и Дании полностью расшифрован геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv — наиболее изученного лабораторного штамма (Cole S.T., Brosch R., Parkhill J. et al. // Nature. 1998. V.393. №6685. P.537—544). Этот самый медленно растущий на искусственных средах микроорганизм имеет довольно большой геном (4 411 529 пар нуклеотидов), 65.6% которого составляют гуанин и цитозин, что соответствующим образом отражается на аминокислотном составе бактериальных белков, которые в свою очередь определяют специфические особенности заболевания. Из 4000 генов 60 кодируют функциональные компоненты РНК: уникальный рибосомальный РНК оперон, 10Sа РНК, участвующий в деградации белков с нетипичной матричной РНК, РНК компонент фермента РНК-азы Р, а также 45 транспортных РНК (тРНК).

Причиной медленного роста микобактерий на искусственных средах, вероятно, служит необычайно большое расстояние между оперонами rrn и сайтами репликации oriC. Гены, кодирующие тРНК, которые узнают 43 из 61 возможных смысловых кодонов, распределены по всему геному. Интересно, что ни одна из многочисленных тРНК туберкулеза не узнает аденин в первой позиции антикодона, что в конечном итоге влияет на ход трансляции. Помимо большого количества гуанина и цитозина в геноме M. tuberculosis имеется множество вставок, повторяющихся по всему геному: IS 6110 — 16 раз, IS 1081 — 6 раз, а также другие повторы с меньшим числом копий. Устойчивость бактериальных клеток к лизису в культуральной среде определяют две профаговые последовательности. Выяснилось, что бактериальная клетка синтезирует все необходимые для своего обмена компоненты — незаменимые аминокислоты, витамины, ферменты и кофакторы. В ее геноме представлены гены самых разных ферментов: липидного обмена, гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути. По сравнению с другими видами бактерий у M. tuberculosis повышена активность ферментов липогенеза. Имеются два гена, которые кодируют гемоглобинподобные белки, играющие роль антиокислительных протекторов или ловушек избытка клеточного кислорода. Эти особенности способствуют быстрой адаптации туберкулезных бацилл к резким изменениям окружающей среды.

Несмотря на полную расшифровку структуры генома палочки Коха, пока не ясен механизм ее патогенности. Понятно только, что в патогенезе играют роль не единичные гены и даже не согласованное действие двух или же нескольких факторов. Ранее было известно, что за вирулентность микобактерий туберкулеза ответственны: ферменты каталаза и пероксидаза, нейтрализующие действие активного кислорода, который продуцируют фагоциты; ген mce, кодирующий макрофаг-колониобразующий фактор и sigma-фактор sig A (aka rpoV), мутация которого может привести к ослаблению жизнеспособности бактерий, а кроме того, клеточная стенка бактерии. Сложность ее состава не позволила пока выяснить механизм вирулентности. Анализ секрета микобактерий показал, что помимо протеаз патогенными свойствами могут обладать фосфолипаза С, липаза и эстераза — ферменты, атакующие клеточные и вакуолярные мембраны тканей человека.

Генетическая карта хромосомы M. tuberculosis H37Rv. На внешнем (цветном) кольце указан масштаб (каждая градация соответствует 106 пар нуклеотидов) и начало транскрипции (0). На первом (после масштабного) кольце показаны позиции стабильных ДНК генов и прямых повторов; на втором — кодирующие рамки; на третьем — инсерционные повторы; на четвертом — семейства генов кислых белков; на пятом — гены белков, богатых глицином; на шестом — множественные копии полиморфных повторов; в центре — содержание гуанина и цитозина. (Cole S.T. et al., 1998)

Иммунологические аспекты туберкулеза

В борьбе с туберкулезом, как и со всякой другой серьезной инфекцией, немаловажная роль отводится своевременной и эффективной вакцинации, а также созданию более действенных лекарств, в частности препаратов нового поколения. В настоящее время наметились основные направления получения новых высокоэффективных средств. Это, во-первых, многообещающая ДНК-вакцина, а также использование в качестве иммуногенных препаратов секретируемых или поверхностных белков возбудителя. Благо, что структура этих белков после полного прочтения генома M. tuberculosis стала известна. Все еще широко распространены традиционные методы вакцинации рекомбинантными формами и ослабленными штаммами M. tuberculosis.

По ходу расшифровки генома микобактерии определены более 90 липопротеинов, среди которых есть ферменты и другие компоненты транспортной системы. Одним из сюрпризов геномного проекта вообще стало открытие обширного семейства двух основных богатых глицином белков, которые, судя по предсказанному нуклеотидному составу их генов, имеют интересные иммунологические особенности и высокополиморфны. Гены этих белков составляют примерно 10% кодирующего сектора всего генома и объединены в компактные кластеры — всего 167 членов обоих семейств. Субклеточная локализация таких белков неизвестна (они вездесущи), как и функции многих белков этого семейства, и поэтому не стоит спекулировать и списывать на них все загадочные метаморфозы с туберкулезной палочкой. Однако в настоящее время установлено, что богатые глицином кислые белки служат причиной антигенной вариации микобактериальной клетки и играют ключевую роль во взаимодействии с иммунной системой хозяина, ингибируя иммунный ответ.

Устойчивость к лекарствам

M. tuberculosis по своей природе нечувствительны ко многим антибиотикам. Это свойство в первую очередь связано с тем, что высоко гидрофобная клеточная поверхность служит своего рода физическим барьером для гидрофильных терапевтических агентов и антибиотиков. Устойчивость микобактерии к антибиотикам и другим терапевтическим средствам обеспечивается также активностью гидролаз, модифицирующих ферментов, таких как бета-лактамаза и аминоглюкозидацетилтрансфераза, и многих других ферментных систем, взаимодействующих с лекарственными препаратами. Однако главная причина устойчивости все же закодирована в структуре генома туберкулезной палочки.

Природа устроена так, что она всегда стремится к сохранению существующего равновесия и естественного порядка, сложившегося на Земле за сотни тысяч и миллионы лет. Любое воздействие сопровождается обязательным противодействием, и проявляется оно в самой неожиданной форме. Возникновение новых штаммов микроорганизмов или же мутантных форм вирусов, с которыми, как правило, человек не готов бороться, — это ответная реакция «мудрой» природы во имя сохранения натурального равновесия.

Неожиданно резкий скачок смертности от туберкулеза — результат действия многих факторов, один из которых — непомерно интенсивное и бесконтрольное использование антибиотиков, с одной стороны, и пренебрежительное отношение к достижениям мировой практики лечения туберкулеза, халатность и низкое качество медицинской культуры — с другой. А о множестве других социальных факторов сегодня можно прочесть почти в каждой газете...

Современная медицинская наука имеет дело не просто с опасным возбудителем туберкулеза, а с целым набором штаммов, устойчивых к разным лекарствам. Естественно, что важно не только обнаружить туберкулезную палочку, а параллельно определить ее резистентность, причем достаточно быстро — в течение двух-трех дней, чтобы вовремя назначить эффективный препарат. По традиционным методам выращивания в культуре M. tuberculosis на получение чистого штамма требуется от трех до восьми недель, для определения его резистентности еще три-шесть недель. Более быстрый радиометрический метод дает результаты не раньше чем через 20 дней.

Но в конце 80-х годов в руках исследователей появился метод, значительно сокращающий время такого анализа. Новая диагностика основана на избирательной амплификации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) in vitro с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (За ее разработку К.Муллис получил в 1993 г. Нобелевскую премию. Подробнее см.: Берлин Ю.А., Белянова Л.П. Лауреаты Нобелевской премии 1993 года // Природа. 1994. №1. С.104—109). Метод имеет фантастические возможности и лежит в основе точной ДНК-диагностики, которая позволяет идентифицировать любой штамм туберкулезной микобактерии и определять первопричину той или иной устойчивости к лекарствам.

Лабораторные исследования показали, что это свойство связано с нуклеотидными заменами (мутациями) в генах, кодирующих различные ферменты, которые непосредственно взаимодействуют с лекарственными средствами. Так, мутации гена rpoB, кодирующего бета-субъединицу РНК-полимеразы (во фрагменте длиной 81 пару нуклеотидов), в 96% случаев приводят к устойчивости M. tuberculosis к рифампицину. Мутации в гене katG, приводящие к замене некоторых аминокислот в ферментах каталазе и пероксидазе, и нуклеотидные замены в регуляторной и смежной кодирующей областях локуса inhA ассоциированы с резистентностью некоторых штаммов микобактерий к изониазиду. Устойчивые к флюорохинолону штаммы имеют аминокислотные замены в альфа-субъединице ДНК-гиразы. Нечувствительность M. tuberculosis к стрептомицину связана с миссенс-мутацией в гене rpsL, кодирующем S12 митохондриальный белок, или с нуклеотидными заменами в гене rrs, кодирующем 16S РНК.

Сравнение генетической структуры нескольких штаммов показало, что устойчивость к рифампицину, обусловленная мутацией в гене rpoB, может служить маркером для определения множественной резистентности — к трем и более противотуберкулезным препаратам.

В настоящее время исследователи (не только за рубежом) с помощью ПЦР в состоянии обнаружить ту или иную мутацию в различных локусах M. tuberculosis и охарактеризовать штамм по устойчивости к лекарствам за кратчайшие сроки, за два-четыре дня. Метод ПЦР довольно прост в исполнении и доступен современной молекулярно-биологической лаборатории далеко не самого высокого уровня. Кроме того, он достаточно дешев по сравнению с теми способами, которые необходимы для изучения нового штамма, секвенирования ключевых полиморфных локусов за очень короткое время. Очевидно, что в настоящее время залог успеха в преодолении надвигающейся на нас туберкулезной «чумы» связан с развитием точной ДНК-диагностики, проведение которой вполне реально в лабораторных условиях.
 

---

---

Октябрь 1999