НАУКА, как известно, "умеет много гитик", а природа неизмеримо больше, многое в ней поражает воображение своей слаженностью и целесообразностью. Недаром техническая мысль нередко стремится уподобить свои рукотворные создания живым организмам или использовать принципы, которыми их щедро наградила природа. Вспомним бионику - одно из направлений кибернетики, в которой особенности строения и жизнедеятельности организмов используются для конструирования новых приборов, механизмов и систем, совершенствования вычислительной техники и т.д. Подражание природе в химии привело к возникновению нового направления - биомиметики, разработке необычных датчиков-биосенсоров.

В биологии появилась и широко распространилась чрезвычайно важная научно-практическая отрасль - биотехнология. Развившись на основе технологии рекомбинантных ДНК и методов промышленной микробиологии, она получила официальное название сравнительно недавно - в 70-х годах. Тем не менее уже сейчас есть области, в которых успехи биотехнологии бесспорны. Например, создано новое поколение лекарств на основе белков человека: генноинженерные инсулин, гормон роста, интерфероны, интерлейкины, эритропоэтин, факторы роста клеток и т.д. Сегодня сумма продаж таких биотехнологических медикаментов в мире превышает 20 млрд долл. США, т.е. составляет 10 - 12% фармацевтического рынка, и в два раза больше сумм, вырученных от продаж антибиотиков, которые, впрочем, тоже представляют продукт биотехнологии.

Созданные методами генетической инженерии трансгенные растения (хлопок, картофель, кукуруза, томаты, табак и другие виды), устойчивые к вирусам, насекомым-вредителям, гербицидам, уже заняли миллионы гектаров на полях некоторых стран1. По сути, это знаменует начало второго этапа "зеленой революции" в сельском хозяйстве.

Потенциал биотехнологии далеко не исчерпан, существует много направлений, которые еще не достигли промышленной реализации, но имеют такую перспективу через 5 - 10 лет.

Здесь речь пойдет об одном таком направлении - биотехнологическом методе получения волокон с уникальным набором полезных потребительских свойств. Имеются в виду всем известные паутина и целлюлоза - полисахарид, широко распространенный в природе, главная составная часть клеточных стенок растений, а также слизистая капсула, которой покрыты многие водоросли и бактерии.

Эту статью можно бы озаглавить "Назад в будущее", ведь природные волокна - шелк, хлопок - употреблялись в хозяйственной деятельности человека на протяжении веков. В нашем же столетии такие волокна в значительной мере вытеснены химическими, но произведенные биотехнологическим способом они вновь могут занять определенное место в технике и быту людей в грядущем веке. И, что немаловажно, их производство, основанное на возобновляемом сырье, будет экологически чистым.

Биотехнология может предложить новые пути рентабельного производства паутинной нити и целлюлозы методом микробиологического синтеза, т.е. без пауков и без растений.

ПАУТИНА - НИТЬ, ПОДОБНАЯ ТУМАНУ

Пауки с древнейших времен привлекали внимание людей своей способностью плести паутину. Само название класса паукообразных (Arachnida) связано с греческим мифом об Арахне, лидийской девушке, которая славилась искусством прясть прозрачные, как воздух, ткани из нитей, подобных туману. Арахна осмелилась соперничать в ткачестве с самой Афиной Палладой и за свою дерзость была превращена богиней в паука. С той поры висит он в паутине и вечно плетет ее.

Первые научные опыты, в которых удалось оценить необычную прочность и эластичность паутины, были осуществлены еще в ХVIII в. Французский исследователь Бон де Сент-Илэз (Bond de Saint-Hilaize) пытался даже разводить пауков для научных целей, но тут же наткнулся на препятствие: при совместном содержании они съедали друг друга. Так что известное выражение "Как пауки в банке", - возникло давно и не без оснований.

Пауки строят из паутины убежища, плетут ловчие тенета и яйцевые коконы, самцы делают из нее сперматическую сеточку, для молоди длинные нити служат парашютами при расселении ветром. Вырабатывается паутинная нить парными железами (их у разных видов пауков от 8 до 16, причем разного строения), которые находятся в брюшке и открываются на паутинных бородавках. Механические свойства паутины, вырабатываемой разными железами, неодинаковы, как и белки, из которых образована нить. Кроме того, пауки могут менять ее толщину и до некоторой степени свойства, выдавливая паутину с разной скоростью. Интересно, что внутри железы макромолекулы белков находятся в растворимом состоянии, и только при выдавливании происходит их аггрегация и ориентация. Благодаря этому и возникает нить - чрезвычайно тонкая, прочная, эластичная и практически не растворимая ни в каких обычных растворителях.

Дальнейший рассказ пойдет лишь об одном сорте паутины - нити основы, самой прочной и толстой (около 5 мкм), из которой строится каркас ловчих сетей. Паук плетёт ее с перерывами, так как выработка паутины отнимает много энергии: произведя 30 - 35 м нити, он восстанавливает силы в течение нескольких дней. (Ясно, что такой производительности недостаточно, чтобы использовать пауков для получения нити, например, в технических целях.)

Механические свойства нити основы уникальны: на разрыв она в пять раз прочнее стали, в два раза превосходит нейлон по эластичности, способна вытягиваться на треть своей длины, обладает малой плотностью и низкой температурой стеклования.

Будучи фибриллярными белками (их полипептидные цепи упорядоченно располагаются вдоль одной оси и образуют длинные волокна, фибриллы), спидроины, из которых построена нить, по аминокислотному составу напоминают белки шелка, фиброины. Те и другие белки содержат необычно большое количество глицина, аланина, много серина и глутамина. Хотя за это паутину называют паучьим шелком, он гораздо прочнее обычного: нагрузка на разрыв для последнего составляет примерно 33 - 43 кгс/мм², а для паутинки - около 260. Эта особенность связана с разным расположением аминокислот в спидроинах и фиброинах. Исследование белков паутины чрезвычайно затруднено тем, что она, как упоминалось, не растворяется ни в чистой воде, ни в присутствии в ней денатурирующих (разрушающих естественную конфигурацию белковых молекул) агентов. До недавнего времени даже представления о размерах спидроинов были на редкость противоречивы.

Принципиальные изменения в изучении этих белков произошли в 1990 - 1992 гг., когда Р.В.Льюис и его коллеги клонировали в клетках Escherichia coli гены спидроинов, составляющих нить основы паука Nephila clavipes. Выяснилось, что эта нить содержит два белка: спидроин-1 и спидроин-2 - очень длинные молекулы размером в несколько тысяч аминокислотных остатков. Первичная структура спидроинов (т.е.чередование аминокислот) была выведена из нуклеотидной последовательности соответствующих генов и оказалась весьма необычной. В ней множество раз повторяются следующие друг за другом одинаковые полипептидные фрагменты: из 34 аминокислотных остатков в спидроине-1 и из 47 - в спидроине-2. Полные повторы обычно перемежаются тремя - четырьмя неполными, в которых отсутствуют от трех до шести аминокислот. Еще одна характерная черта белков паутины - довольно протяженные полиаланиновые участки.

В нашем институте уже несколько лет проводится работа по клонированию генов спидроинов. Чтобы начать ее, нужно было получить исходный генетический материал. Здесь, видимо, следует вкратце напомнить принцип биотехнологического получения какого-либо природного полимера, будь то антибиотик, интерферон, инсулин или, как в нашем случае, спидроин. Заставить какой-либо организм синтезировать несвойственный ему, чужеродный, белок можно одним способом: ввести в геном тот ген (разумеется, со всем необходимым сопровождением, т.е. с регуляторными последовательностями), которым кодируется этот полимер. Но прежде предстоит выделить этот ген из ДНК клеток организма-хозяина, в нашем случае - паука. Нередко, когда синтез чужеродного белка "поручается", скажем, кишечной палочке (E.coli), биотехнологическому процессу предшествует получение не самого гена, а его "слепка" (транскрипта), т.е. информационной РНК (иРНК). Дело в том, что Е.соli, будучи прокариотическим организмом, не имеет так называемой системы сплайсинга (от англ. to splice - сращивать) - удаления из нуклеотидной последовательности, уже "переписанной" на язык РНК, интронов (незначимых для структуры белка участков). А поскольку в зрелой иРНК организма-хозяина интроны уже вырезаны, то ее и используют, чтобы получить с помощью специального фермента (обратной транскриптазы) интересующий ген, размножить (клонировать) его и "вставить" в ДНК микроорганизма. Вся биотехнологическая процедура сложна и многоступенчата, и мы еще будем обсуждать некоторые ее детали, а сейчас вернемся к паутине.

Информационную РНК спидроинов можно выделить из ампульных желез паука. Мы выбрали крестовика Уемуры (Araneus uemura) - самого крупного представителя крестовиков, который обитает в Южном Приморье. Известно, что наиболее мощные сети строят половозрелые самки в конце августа, когда плетут яйцевые коконы. Стало быть, в это время активнейшим образом работают гены спидроинов, и, следовательно, в ампульных железах больше, чем в другой период, содержится нужной иРНК.

Крестовики были отловлены на о-ве Попова, и одних "доили", чтобы получить паутинные нити, а другие, точнее, их ампульные железы, послужили источником для выделения иРНК спидроинов.

Для "доения" пришлось разработать специальную методику, позволившую изолировать все бородавки, кроме одной передней, и только из нее тянуть нить. В большинстве случаев удавалось вытянуть довольно длинную паутинку, но если паук был ослаблен голодом и стрессом, она быстро обрывалась.

Сухая паутина использовалась для определения N-концевой последовательности аминокислот, но, к сожалению, получить достоверных результатов не удалось. Это связано, очевидно, с наличием у спидроинов "рваных концов" - белковых цепей с разными N-концевыми остатками.

Надо сказать, что структура паутинной нити исследуется во многих лабораториях мира с применением всего арсенала современных методов, включая рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс, просвечивающую электронную микроскопию, масс-спектрометрию и т.д. Хотя эти работы еще не завершены и детали стуктуры уточняются, общая архитектоника нити стала понятной.

Сама каркасная нить состоит из многих переплетенных между собой молекул спидроина. Каждая из них представляет собой чередующиеся альфа-спиральные участки (обогащенные глицином) и бета-складчатые слои, уложенные антипараллельно и содержащие полиаланиновые фрагменты. В нити паучьего шелка альфа-спиральные участки образуют аморфный неупорядоченный матрикс, в который погружены кристаллы (50 · 50 нм²) из бета-слоев. Примечательно, что существуют две субпопуляции кристаллической фазы: кристаллы одной строго ориентированы вдоль оси волокна, в другой ориентация слабая. Содержание кристаллической фазы оценивается, по разным данным, от 30 до 45%. Таким образом, паучий шелк представляет собой композитный материал, в котором кристаллическая часть отвечает за прочность, а аморфная - за эластичность.

Описанная здесь вторичная структура спидроинов в виде серии антипараллельных складчатых бета-слоев, перемежающихся неупорядоченными участками, формируется в процессе биосинтеза уже в железах паука. Во время выдавливания из них длинные молекулы спидроинов, которые находятся в растворимом состоянии, ориентируются в потоке и области складчатых бета-структур разных молекул, накладываясь друг на друга, образуют кристаллы. Из-за того, что одни и те же аминокислотные последовательности (вспомним, по 34 и 47 остатков у разных спидроинов) многократно повторяются, молекулы могут агрегировать "с перехлестом", благодаря чему образуется непрерывная нить. Кстати, пауки могут менять ее свойства именно в процессе выдавливания паутины. Так, если увеличить вес паука, вращая его в центрифуге, он выделяет более толстую и прочную, но менее жесткую паутину.

Что же сделано современными биотехнологами на пути рентабельного производства паучьего шелка микроорганизмами? Мы упоминали, что расшифровать первичную структуру спидроинов удалось по нуклеотидным последовательностям их генов, которые были клонированы в клетках E.coli. Значит, в принципе можно заставить работать эти гены (экспрессироваться) с такой интенсивностью, чтобы в кишечной палочке синтезировались преимущественно спидроины. Казалось бы, при современных успехах биотехнологии сделать это довольно просто: следует подставить гены под сильные промоторы (фрагменты последовательности ДНК, к которым присоединяется фермент РНК-полимераза, чтобы начался синтез, транскрипция, информационной РНК); организовать структурные участки для оптимального начала (инициации) и окончания (терминации) биосинтеза белка (трансляции). Иными словами, нужно создать экспрессионную кассету.

(Для любознательных читателей неспециалистов поясним, что делает сильный промотор. Он позволяет считывать с одного и того же гена до нескольких тысяч молекул иРНК. Например, в одной клетке железы тутового шелкопряда ген фиброина - основного белка натурального шелка - воспроизводится в 104 копиях иРНК и на каждой из них синтезируется 105 молекул фиброина. Столь громадную производительность и обеспечивает сильный промотор.)

Именно таким образом сконструированы сотни продуцентов для уже упомянутых биологически активных белков человека - инсулина, фактора роста и др.

Так же, начав с выделения иРНК из паутинных желез крестовика Уемуры и выполнив все обычные процедуры, мы внедрили гены спидроинов в состав коммерческого вектора и клонировали их в клетках E.coli. Сделаем очередное отступление. Вектором, т.е. переносчиком генов в бактериальную ДНК, могут быть вирусы, плазмиды (кольцевые ДНК), специально модифицированные и снабженные необходимыми для активного биосинтеза элементами. Сейчас биотехнологам почти не приходится конструировать векторы, так как этим занимаются специальные фирмы.

Так вот, в составе полученной нами клонированной ДНК были обнаружены повторяющиеся последовательности, близкие повторам в гене спидроина-1 паука N.clavipes, но не идентичные им. Это вполне естественно - ведь у нас был другой вид паука. Но конечная цель биотехнологических процедур - получить интересующий продукт гена. Нам это не удалось, ни одна попытка не завершилась биосинтезом спидроина паука в клетках E.coli. Заметим (на полях), что мы достигли этого обходным путем: в плазмиду, предназначенную для доставки в ДНК E.coli гена человеческого интерлейкина-3, был вставлен ген спидроина. В результате кишечная палочка стала производить его в слитном составе с интерлейкином.

Надо сказать, что со многими трудностями биотехнологического способа получения спидроинов столкнулись и другие исследователи.

На самом деле подобным неудачам есть веские причины, и связаны они с особенностями структуры спидроинов, да и вообще фибриллярных белков.

Первая из них - огромные размеры этих полимеров. Если они состоят из нескольких тысяч аминокислотных остатков, то количество нуклеотидов в структурных генах должно быть по крайней мере в три раза больше. А столь длинные гены невозможно внедрить в плазмиду, поэтому встраивают не все повторяющиеся нуклеотидные фрагменты, а лишь несколько.

Еще одна причина неудач - многократная повторяемость одинаковых генетических фрагментов. Именно она может приводить к генетической нестабильности бактериального хозяина. Правда, ее удается избежать, как показали исследователи из лабораторий концерна "DuPont", если сконструировать довольно протяженные блоки - примерно из 300 пар нуклеотидов.

Очень высокое содержание некоторых аминокислот - более 40% глицина, более 20% аланина, в том числе и его протяженные монотонные последовательности, - тоже затрудняют полноценный биосинтез спидроинов. Во-первых, может происходить сдвиг рамки считывания, что приведет к сбою трансляции. (В зависимости от того, с какого нуклеотида в кодоне начнется считывание генетической информации, в принципе могут образоваться три разные аминокислотные последовательности.) Во-вторых, из-за недостатка в клетках E.coli транспортных РНК (тРНК), поставляющих к месту синтеза полипептидной цепи аланин и глицин, которых очень много в спидроинах, образуются не только крупные фрагменты этих белков, но и набор более коротких пептидов.

И, наконец, последнее затруднение. Оно связано с тем, что одной и той же аминокислоте соответствует несколько разных кодонов (сочетаний трех нуклеотидов): для аланина и глицина, например, их по четыре. А в натуральном гене паука используются преимущественно не те кодоны, которые предпочитает E.cоli. К счастью, эта трудность не принципиального, а технического характера, так как с помощью химического синтеза можно изменить кодоны в гене на более приемлемые для бактериального хозяина.

С перечисленными трудностями столкнулись, как упоминалось, многие исследователи, тем не менее биотехнологам "DuPont" удалось получить некоторое количество аналогов спидроинов в растворимом виде. Эти растворы оказались чувствительными к гидродинамическим сдвигам, благодаря которым белок переходил в нерастворимую форму. Короче говоря, из таких растворов довольно легко приготовить нить.

Судя по результатам разных экспериментов, E.coli и, вероятно, бактерии вообще - не лучшие хозяева для производства крупных фибриллярных белков. Гораздо лучшим хозяином оказались метилотрофные дрожжи Pichia pastoris. Этот эвкариотический микроорганизм производил моделирующие спидроин полипептиды размером до 1000 аминокислотных остатков с выходом 1г/л. Примечательно, что штаммы дрожжей были стабильными - не изменялись по крайней мере в течение 100 генераций. А это очень важно для биотехнологических целей, поскольку генетическая нестабильность препятствует биосинтезу белков паучьего шелка.

В настояшее время мы тоже приступили к конструированию системы для синтеза спидроина-1 в дрожжах, но другого вида - Saccharomices cerevisiae. Не исключено, что в обозримом будущем биотехнологи научатся получать такого рода белки в растениях или в организме тутового шелкопряда.

Итак, ясно, что биотехнологический процесс синтеза паучьего шелка еще только разрабатывается. Тем не менее достигнутые успехи уже сегодня открывают широкие перспективы в изучении связи между структурой макромолекул и свойствами нитей искусственной паутины. Привлекательная особенность биотехнологического пути - матричный синтез белка, дающий совершенно одинаковые молекулы. А это принципиально не достижимо при химической полимеризации более простых полимеров. Не исключено, что в дальнейшем биотехнологи смогут конструировать полимеры, которые по своим свойствам превзойдут натуральную паутину. Кроме того, принципы, позаимствованные у природы, могут оказаться полезными и при создании химических полимеров.

Для чего же биотехнологи ломают копья, пытаясь заставить разные организмы производить паучий шелк? Где могут найти применение эти нити, подобные туману?

Каркасную нить пауков начали применять с 1880 г. в качестве рисок в телескопах и других оптических приборах. В ходе второй мировой войны потребности в паутине были столь велики, что в США поставками ее для нужд армии занимались 10 небольших фирм. По мнению современных специалистов, паучий шелк - идеальный материал для парашютного корда, бронежилетов, шовных нитей в хирургии и многого другого. И теперь это уже не фантазия. Например, все та же компания "DuPont" объявила, что в течение 5 - 7 лет может организовать производство такого рода полимеров для специальных технических целей.

ЦЕЛЛЮЛОЗА ИЗ БАКТЕРИЙ

Другое природное волокно, издревле используемое человеком, - целлюлоза. Это самый распространенный на Земле биополимер: в камыше, злаках и подсолнечнике его масса составляет 30 - 40%, в древесине - 40 - 50%, в стеблях льна и джута - 75 - 90, а в волокнах хлопка - 95. Значение целлюлозы в хозяйственной деятельности человека огромно: из нее получают хлопчатобумажные ткани, бумагу, картон; производные этого природного полимера служат для изготовления вискозного и ацетатного волокон, целлофана, пластмассы и лаков, бездымного пороха и т.д.

Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид, образованный не менее чем 500 остатками глюкозы (в целлюлозе древесины их 2 - 3 тыс., а льна - до 30 тыс.). Путь его биосинтеза, начиная с глюкозы до непосредственного предшественника полимера - уридиндифосфатглюкозы, описан в любом учебнике биохимии, хорошо известны ферменты, осуществляющие этот процесс в растениях. Но, как это ни странно, до сих пор нет исчерпывающих данных относительно ферментов и точного механизма самой полимеризации, т.е. прибавления очередного звена глюкозы к растущему концу полимера. Известно, что позвенное наращивание производится комплексом белков (с общим названием целлюлозосинтазы), связанным с мембраной, и можно предположить два механизма: либо комплекс передвигается по нити растущего полимера, либо сам полимер проталкивается через ферментативный комплекс. Каждый такой комплекс, видимо, синтезирует 60 - 70 цепей целлюлозы, которые, будучи "прошиты" водородными связями, образуют одну микрофибриллу длиной во много микрометров. Структура фибрилл не однородна по длине, в ней есть кристаллические зоны со строго упорядоченной упаковкой молекул и аморфные. В бактериальной и древесной целлюлозах обнаружены два типа кристаллических структур - 1_альфа и 1_бета , но если в древесном полисахариде их 30 и 70% соответственно, то в бактериальном - 60 и 40. С этим, очевидно, и связаны различия в свойствах таких целлюлоз.

Полагая, что укладка цепей происходит по мере их полимеризации, этот процесс и исследуют специалисты с конца 80-х годов (с тех пор на эту тему опубликовано более 200 работ). Наиболее простая модель для его изучения - бактериальная клетка, поскольку давно известно, что некоторые бактерии, синтезируя целлюлозу, выделяют ее через поры на свою поверхность.

Механизм биосинтеза изучается главным образом в клетках бактерий рода Acetobacter. К настоящему времени обнаружены четыре гена (А, В, С и D), которые кодируют белки целлюлозосинтазного комплекса. Установлено, что гены находятся в одном опероне (участке ДНК, информация которого считывается на одну молекулу иРНК). Если инактивировать любой из первых трех генов, синтез целлюлозы прекратится, но выключение гена D приведет только к снижению продукции на 40%, правда, при этом изменятся и свойства целлюлозы.

Благодаря просвечивающей электронной микроскопии удалось увидеть секрецию микрофибрилл из пор, расположенных на поверхности бактериальной клетки. Растущая нить постепенно утолщается по мере приближения к поре, собирается сначала в пачки, потом в ленту и, наконец, покидает поверхность клетки. По способности создавать ультратонкие нити (их диаметр всего 0.05 мкм, т.е. фибрилла в 100 раз тоньше паутины и в 200 раз - волокон растительной целлюлозы) бактерии не знают себе равных среди всех других организмов и пока превосходят технические возможности людей.

Высушенные листы очищенной микробиологической целлюлозы имеют самый высокий модуль Юнга (коэффициент пропорциональности между напряжением и деформацией) из всех плоскоориентированных слоев органических полимеров. Удельный модуль Юнга, который рассчитывается как его отношение к плотности, одинаков для пластин алюминия и бактериальной целлюлозы. Это свойство уже сегодня привело к ее широкому использованию в акустических мембранах для радиотехники. Бактериальный полисахарид находит и другое применение - в композитных материалах. Тонкие нити целлюлозы могут удерживать вместе материалы, например стекло и волокно, которые в норме не связываются друг с другом. Ряд таких композитов запатентован.

Бактериальную целлюлозу издавна используют в пищевой промышленности. Кстати, еще в 1886 г. английский исследователь Браун установил, что желатинообразная субстанция десерта (традиционного для индонезийской кухни), образуемая бактериями, представляет собой целлюлозу.

Сейчас интенсивно изучается возможность ее применения в медицине, косметике... и даже технике бурения скважин.

Надо сказать, что для промышленного производства бактериальной целлюлозы нет надобности в технологии рекомбинантных ДНК, бактерии сами способны синтезировать полимер. В настоящее время хорошо разработан процесс культивирования микроорганизмов, производящих бактериальную целлюлозу, освоена технология ее производства, в результате чего она стала коммерчески доступной.

* * *

Итак, благодаря удивительным свойствам природные волокна не утратят своего значения в хозяйственной деятельности человека. Наоборот, в новом веке они могут быть востребованы не только для пищевых и медицинских, но и самых разных технических целей. А специалисты в области химии полимеров могли бы позаимствовать некоторые принципы организации природных макромолекул, чтобы создавать новые полимеры. И все это благодаря биотехнологии, которая уже сейчас все заметнее вторгается в нашу повседневную жизнь.