VIVOS VOCO: Д.Н. Островский, "Третья линия обороны"

ТРЕТЬЯ ЛИНИЯ ОБОРОНЫ

Доктор биологических наук Д.Н. Островский

Извините, по техническим причинам не вставлены рисунки - V.V.

Инфекционные болезни ежегодно уносят миллионы человеческих жизней. Малярия и холера, СПИД и проказа все еще досаждают человеческому роду, но более всего жертв приходится на долю туберкулеза. За год от этой болезни, часто называемой социальной, погибает 3 миллиона человек и появляется 8 миллионов новых больных. При этом число заболевших неизменно растет во всех странах мира, а особенно быстрыми темпами - в России.

"Куда же смотрят наши химики? - могут спросить читатели. - Ведь они уже не один десяток лет занимаются поиском эффективных противотуберкулезных препаратов".

Химики стараются, и лекарства есть: тубозид, этамбутол, стрептомицин, рифампицин и другие. Но возбудители действуют как террористы, прячущиеся за спинами заложников, - известными методами их трудно уничтожить, не повредив мирные ткани.

Человеческий организм сам борется с проникшими в него бактериями, которые захватывают клетки фагоцитов, с помощью так называемого окислительного стресса - повышения концентраций активных форм кислорода (например, супероксидного радикала O₂^.-, перекиси водорода H₂O₂ и других). Окружив мембраной бактерию в специальной вакуоли, фагоцит включает систему генерации активных форм кислорода, создает вокруг бактерии систему генерации активных форм кислорода, создает вокруг бактерии кислотную среду, синтезирует ферменты, растворяющие бактериальные оболочки (рис. 1).

Рис. 1. Фагоцит борется с бактериями так. В фагцитарную вакуоль (В), в которой заключена бактерия (Б), встраиваются пузырьки, содержащие антибактериальные пептиды-дефенсины (Д) и ферменты, растворяющие бактериальную стенку, - например, лизоцим (Л). С помощью аденозинтрифосфатазы (Н⁺-АТФазы) в клетку впрыскиваются протоны, подкисляющие среду, а специальный ферментный комплекс, окисляя восстановленную форму никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ-Н), образует активные формы кислорода, атакующие бактериальную клетку.

Однако природа одинаково любит все свои творения. Болезнетворные бактерии и сами наделены могучими и постоянно совершенствующимися средствами борьбы с факторами иммунитета хозяина. Толстая оболочка бактерий и высокая концентрация содержащихся в них антиоксидантов - например, глутатиона - задерживают и нейтрализуют значительную часть активных форм кислорода (рис. 2), образуя, так сказать, первую линию обороны паразита.

Рис. 2. Бактерии защищаются так. Сначала активные формы кислорода реагируют с компонентами клеточной стенки, с мембранными антиоксидантами и водорастворимыми антиоксидантами цитоплазмы - например, глутатионом (GSH). Окислители реагируют также с чувствительными белками на поверхности генетического аппарата бактерии, способствуя активации большого набора генов (оху R) и синтезу до 50 новых защитных белков - например, каталазы (К), супероксиддисмутазы (С) или пероксидазы (П). Окислители также модифицируют белки, придавая им новые ферментные функции, что ведет к накоплению нового циклопирофосфата (RPP)

Далее по сигналу тревоги включаются в работу особые участки генетического аппарата бактерии, которые начинают вырабатывать в больших количествах каталазу, супероксиддисмутазу и другие ферменты, разрушающие пероксиды. Это - вторая линия обороны бактерии. Однако она может вступить в дело только при надежной работе всех систем, обеспечивающих клетку энергией, стройматериалами и молекулярными машинами. А если удар, полученный бактериальной клеткой, очень силен и внутриклеточные механизмы пришли в расстройство?

Для такого случая необходимы силы быстрого реагирования, и результаты недавних исследований, выполненных нами в Институте биохимии РАН, показывают, что у бактерий такие силы, по-видимому, действительно есть и они составляют как бы третью линию обороны. Этот эффект проявляется в накоплении в клетках дотоле неизвестного органического соединения фосфора.

Что представляет собою новое соединение? Его структурная формула изображена на рис. 3а, а точное химическое название звучит так: (2S,3R)-метил-1,2,3,4-тетраоксибутан-2,4-циклодифосфат. Для простоты мы чаще называем его 2-С-метил-D-эритритол-2,4-циклопирофосфатом или, еще проще, циклопирофосфатом метилэритрата, сокращенно МЭЦ.

В кислотной среде пирофосфатная связь этого вещества легко разрывается, превращая МЭЦ в обычный 1,4-дифосфат, а в щелочной среде, при рН7, энергия разрываемой связи используется на перестройку кольца с образованием 2-метилбутан-1,2,3,4-тетраол-1,2-цикло-4-дифосфата (рис. 3б).

Рис. 3. Структурные формулы нового циклопирофосфата (а), выделенного из микобактерий, микрококков и коринебактерий, и продукта его самопроизвольного перезамыкания (б)

Из какого соединения-предшественника возникает МЭЦ и во что превращается далее, мы пока не знаем, но выяснилось (и это очень важно), что накопление МЭЦ, начинающееся в клетках бактерий в присутствии окислителей, не нуждается в биосинтезе белка. Таким образом, ферменты синтеза МЭЦ, по-видимому, существуют в клетках постоянно, но только взаимодействие с окислителем меняет характер их активности и приводит к накоплению МЭЦ.

Концентрация МЭЦ в цитоплазме бактерий достигает 100 миллимолей, что превышает концентрацию всех остальных растворимых клеточных фосфатов вместе взятых, причем вещество остается свободным, то есть не связывается со структурами клетки и не образует нерастворимых агрегатов, подобно многим другим полифосфатам.

Среди продуцентов циклофосфата метилэритрита оказались микрококки, родококки, бревибактерии, а также коринебактерии и микобактерии - близкие родственники возбудителей печально известных болезней - туберкулеза, проказы, дифтерии. А вызывают накопление этого фосфата любые соединения, способные к обратимому восстановлению-окислению с образованием О₂^.-, - например, широко применяемые в медицине и в быту лекарства нитрофуранового ряда (фурациллин и фурадонин), пестициды (паракват, дикват, бензилвиологен, линурон), дезинфицирующая композиция Дезоксон-I, а также имеющие некоторое медицинское применение метиленовый синий и менадион и даже озон. К чему это приводит?

Оказалось, что бактерии-продуценты МЭЦ способны развиваться в присутствии таких веществ, создающих окислительный стресс, а бактерии, не способные к накоплению МЭЦ, в этих условиях прекращают рост или погибают (рис. 4а). Иными словами, что-то очень важное для выживания бактерий в смертельно опасных для них условиях кроется за фактом накопления МЭЦ; зная же химические механизмы, посредством которых бактерии себя защищают, можно надеяться найти и новые методы борьбы с заболеваниями, которые они вызывают, - в данном случае с туберкулезом. Однако в туберкулезных бациллах, культивируемых на искусственных средах, МЭЦ не оказалось, а получить бактерии от больного в количествах, достаточных для исследования их химического состава, - дело весьма сложное.

Рис. 4. Способность к накоплению циклопирофосфата помогает бактериям перенести действие чрезвычайно неблагоприятных факторов: а) бактерии-продуценты МЭЦ (Br.ammoniagenes) хорошо растут в присутствии индукторов окислительного стресса, а бактерии, не накапливающие МЭЦ (St. aurens, Bac. subtilis), почти не растут или плохо переносят эти условия (пунктирная линия - рост на обычной среде, сплошная линия - рост на среде с фурациллином); б) обычные клетки E.coli быстро погибают после поглощения их макрофагами из брюшной полости мыши (I), а клетки E.coli, приобретшие способность накапливать МЭЦ благодаря переносу некоего гена из коринебактерий-продуцентов МЭЦ, выживают в макрофагах гораздо дольше (2)

К этому времени новым явлением заинтересовались наши коллеги из НИИ туберкулеза, НИИ по контролю ветпрепаратов и Гематологического научного центра, что позволило воспользоваться методами генной инженерии.

Если фагоцитам мыши предложить в пробирке клетки E.coli, то они поглотят и переварят бактерий; если же в "съедобную" бактерию ввести гены вирулентности из болезнетворных бактерий, то поглощение и переваривание становятся затруднительными или прекращаются совсем. Проверенный по такой схеме рекомбинантный клон в сравнении с клоном E.coli, несущим такую же плазмиду, но без вставки чужеродной ДНК, оказался более живучим (рис. 4б).

Участки клонированной ДНК и ее небольшие синтетические фрагменты были использованы для поиска сходных участков ДНК у других бактерий. Такие участки были действительно обнаружены у некоторых штаммов микобактерий - возбудителей туберкулеза животных и человека. Однако гены синтеза МЭЦ все еще предстоит выделить.

Интерес иммунологов и инфекционистов к этому веществу подогревается тем обстоятельством, что недавно в крупнейших центрах Франции, Германии и США из туберкулезной бациллы была выделена группа соединений, вызывающих прямую активацию и размножение иммунных клеток человека. Так вот, новые соединения оказались низкомолекулярными пирофосфатами, очень похожими по физико-химическим свойствам на наши образцы, хотя их структура еще не определена окончательно. Стало понятно, что судьба новых иммунномодулянторов из туберкулезной бациллы и судьба циклопирофосфата из безвредных микобактерий управляются одной и той же группой генов, изучение которых открывает новый путь к преодолению болезни.

Итак, у туберкулезных бактерий есть ферменты синтеза МЭЦ. Но какую именно роль в патогенезе они выполняют? Возможно ли развитие болезни при отсутствии (или в результате искусственного удаления) ферментов превращения МЭЦ? Правильный ответ на эти вопросы позволит, по-видимому, сконструировать новую живую "человеческую" вакцину от туберкулеза, роль которой сейчас выполняет вакцина животного происхождения - БЦЖ. Другое возможное направление исследований состоит в химической модификации МЭЦ с целью получения лекарственных соединений, оказывающих иммунномодулирующее действие, то есть способных усиливать антибактериальную активность клеток иммунной системы человека.